Контрольные вопросы:
Какие фазы выделяют при силосовании кормов.
Какие микроорганизмы характерны для первой фазы.
Показатели хорошего силоса.
Раздел 2. Инфекция и иммунитет Тема 2.1.Серологические реакции. Реакция агглютинации (ра).
Цель занятия: ознакомить студентовс сущностью серологических реакций и их применением; изучить реакцию агглютинации (РА) и варианты ее постановки.
Содержание:
Разновидности серологических реакций.
Постановка РА.
Модификации РА.
Антигены – генетически чужеродные вещества (белки), которые при попада- нии в организм вызывают ответную реакцию – продуцирование организмом анти- тел. Антигены бывают корпускулярные (молекулы), клеточные (бактерии, эритро- циты) и растворимые (молкулярно-дисперсионные). Антигены имеют рецепторы для связывания со специфическими антителами, как в организме (invitro), так и в пробирке (invivo). Антигенной активностью обладают не только полноценные ан- тигены (белки), но и гаптены (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс и др.).
Антитела – высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины).
По феномену взаимодействия антигена с антителом выделяют реакции оса- дочные, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в данных реак- циях: агглютинины – вызывают агглютинацию и осаждение комплекса; преципи- тины – образуют преципитат с растворимым антигеном. В реакциях лизиса участ- вуют бактериолизины и гемолизины (лизируют антиген). Нейтрализующие анти- тела обезвреживают, нейтрализуют токсическое действие антигена.
При постановке серологических реакций один из компонентов всегда извес- тен. Компоненты разводят на физиологическом растворе.
РА является серологической (serum - сыворотка). В основе всех серологиче- ских реакций лежит специфическая реакция между антителом и антигеном.
Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки (со специ- фическими антителами) к равномерной взвеси антигена происходит их склеивание
(глыбки, комочки, хлопья), постепенно оседают на дно пробирки, формируя
рий, имеющих жгутики
(подвижные виды), и в агг-
Рисунок 69 - Реакция агглютинации.
лютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, форми- руется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат.
В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, саль- монеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других забо- леваний.
Существует несколько методов постановки РА.
Для определения антител (по известному антигену) берут 5-10 мл крови из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и поме- щают в теплое место. После образования сгустка осторожно (стерильно!) отделя- ют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасы- вают в стерильные пробирки, нумеруют их, с нарочным и препроводительным письмом отсылают в лабораторию. Используют свежие сыворотки без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолатом натрия или борной кислотой. Анти-
ген
для РА представляет собой взвесь в
физиологическом растворе убитых или
106
живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства. Если же необходимо идентифицировать бактери- альную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стан- дартные сыворотки,а антиген готовят из суточной культуры -смыва с МПА.Спе- цифические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально подлогов ленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Го- товую сыворотку консервируют, разливают и ампулы и запаивают. Нередко диаг- ностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреб- лением такие сыворотки разводят дистиллированной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором.
Постановка РА классическим (пробирочным) методом. Исследуемые сы- воротки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции произ- водят соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции).
Например, для диагностики бруцеллеза сыворотки разводят 1:25, 1:50, 1:100,
1:200, 1:400.
Удобно разведения производить следующим образом. В отдельной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворотки - 1:25, смешивая 0,1 мл испы- туемой сыворотки с добавлением 2,4 мл физ.раствора. В опытные пробирки раз- ливают по 1 мл физ.раствора. Затем из исходного разведения 1 мл жидкости пере- носят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1:50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1:100), из второй 1 мл - в третью и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы и каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки. Во все пробирки добавляют по две кап- ли стандартного антигена (концентрация 10 млрд. микробных тел в 1 мл), смеши- вают встряхиванием и выдерживают в термостате 4-6 ч при 37 °С, а затем при комнатной температуре 14-16 ч.
При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают сыворотку нормальную (от здорово-
го животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном.
Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора добавляют две кап- ли антигена для исключения самоагглютинации.
Учет РА проводят невооруженным глазом, начиная с контрольных пробирок.
Результат РА принято выражать количеством крестов:
++++ (#) - полное просветление жидкости, образовавшийся агглютинат в виде перевернутого зонтика, при встряхивании разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной;
+++ ( ) - неполное просветление жидкости, характер агглютината, как и в предыдущем, в виде зонтика, при встряхивании разбивается на более мелкие глыбки, комочки;
++ ( ) - обозначают РА неполную, с неполным просветлением жидкости, агг- лютинат в виде зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной вели- чины, жидкость мутная;
+ - наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность;
- (минус) - вся жидкость в пробирке мутная, на дне пробирки небольшой оса- док антигена с ровными краями в виде «пуговки» и при встряхивании разбивается в равномерную муть.
3-4 креста - положительная РА; 2 креста – сомнительная;
1 крест или его отсутствие – отрицательный результат.
Капельный (пластинчатый) метод РА используют для быстрого обследо- вания поголовья животных в лаборатории и в условиях хозяйства (рисунок 70). На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой исследуемую сыворотку по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл. К каждой сыворотке добавляют по одной капле ан- тигена определенной концентрации, постепенно смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего количества сыворотки. Условно считают, что
сыворотка в первой капле соответ- ствует разведению 1:50, во второй - 1:100, в третьей - 1:200, в четвертой
-1:400.Через2-3 мин производят учет. Для ускорения реакции стекло слегка подогревают высоко над пламенем горелки. Положительный результат проявляется образовани- ем в капле сыворотки комплекса антиген-антитело в виде крупинок, хлопьев, жидкость становится про- зрачной. При отрицательном ре- зультате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мут- ной (отсутствие в сыворотке анти- тел).
Кровяно-капельный метод РА чаще применяют для диаг-
Рисунок 70–Капельный (пластинчатый)