2. Гематологические автоанализаторы

2.1. Принцип метода определения счета клеток крови

Гематологический анализатор – это счетчик клеток крови и определения их характеристик, основными параметрами которого являются значения количества эритроцитов RBC, лейкоцитов WBC и тромбоцитов PLT.

В настоящее время выпускается огромное количество различных моделей гематологических автоанализаторов. Классифицировать их можно по различным признакам: числу определяемых параметров, принципу метода технического решения, стоимости и степени автоматизации.

По числу определяемых параметров гематологические анализаторы делятся сегодня на 4 группы:

1) 8 – 9 параметров + 3 гистограммы,

2) 16 – 20 параметров + 3 гистограммы,

3) 20 – 28 параметров + 3 гистограммы + 3 скэтограммы,

4) 28 – 40 параметров + 3 гистограммы + 6 скэтограмм.

Первая группа анализаторов определяет: количество эритроцитов (RBC), средний объем эритроцита (MCV), распределение эритроцитов (RDW), количество лейкоцитов (WBC), гемоглобин (HGB), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (MCHC), гематокрит (HCT).

Вторая группа содержит расчетные показатели эритроцитов и тромбоцитов (PLT); дифференцировку лейкоцитов на 3 популяции – нейтрофилов, лимфоцитов и гранулоцитов; гистограммы распределения по объему эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов.

Анализаторы, входящие в третью группу производят полную дифференцировку лейкоцитов по пяти параметрам (лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы, нейтрофилы); построение скаттерограмм, а также гистограмм распределения лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов по объему.

К четвертой группе относятся высокотехнологичные гематологические автоанализаторы, выполняющие развернутый анализ крови с дифференцировкой лейкоцитов по пяти параметрам; подсчет и анализ ретикулоцитов; построение гистограмм распределения и скаттерограмм.

По способу подготовки проб гематологические анализаторы делятся на две группы: автоматические и полуавтоматические. В полуавтоматических анализаторах подготовка проб отделена от анализа и производится в специальных приборах – дилютерах. Автоматические анализаторы работают с предразведенной кровью и непосредственно с цельной кровью.

Для гематологического анализа может использоваться как капиллярная, так и венозная кровь. Использование венозной крови с точки зрения аналитической точности более предпочтительно, однако широкое ее применение ограничивается отсутствием в обращении закрытых систем взятия материала и высокой инвазивностью самой методики взятия крови.

В гематологических анализаторах чаще всего используются 3 метода измерения: лазерный метод для дифференцировки лейкоцитов по пяти популяциям, импедансометрический (кондуктометрический) метод для подсчета общего количества клеток, фотометрический метод для измерения гемоглобина.

Долгое время в гематологии для подсчета и анализа клеток использовали ручные методы исследований. Концентрацию клеток определяли визуальным подсчетом в камере Горяева, а морфологические характеристики – исследованием мазка крови под микроскопом.

Усовершенствование гематологических приборов и системы реагентов облегчает выполнение рутинных операций по определению количества эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов, включая процентное количество клеток трех основных субпопуляций лейкоцитов: лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов.

Каждый гематологический анализатор, как правило, рассчитан на свою собственную реагентную систему, однако между ними есть много общего. Основными составляющими комплектов реагентов для гематологических анализаторов являются:

- изотонический (буферный) разбавитель;

- лизирующий раствор;

- промывающий раствор (после каждой пробы);

- промывающий раствор (для глубокой очистки системы);

- очищающий раствор (для экстренной очистки датчика и/или сервисных работ).

В зависимости от конкретной конструкции анализатора в базовый комплект входит лишь часть указанных реагентов, но обязательными являются 3 первых из перечисленных выше реагентов.

Надежная работа гематологического анализатора требует использования реагентов с хорошо проконтролированной чистотой. Дилюент должен хорошо разбавлять клетки, чтобы обеспечить прохождение только одной клетки через апертуру в данный момент времени. При прохождении через апертуру более одной клетки прибор должен автоматически корректировать данные. Если две или более клетки проходят через апертуру одновременно, прибор фиксирует один импульс, вызывая ошибку в подсчете. Величина ошибки является функцией от концентрации образца и размера апертуры. Прибор автоматически корректирует результаты с помощью соответствующей поправки.

Таким образом, важнейшими элементами импедансной системы многопараметрового счета элементов крови являются: соответствующие реагенты; адекватное разведение; адекватное перемешивание исследуемого образца крови.

В данном издании рассмотрим гематологический анализатор, разработанный на основе кондуктометрического метода.

Суть метода заключается в том, что все измерения происходят в проточной электрохимической ячейке, имеющей маленькое отверстие – апертуру. Электрическое поле создается в апертуре, через которую проходят клетки крови, разведенные в изотоническом растворе. Прохождение каждой клетки через апертуру повышает ее сопротивление прямо пропорциональное размеру клетки. Прибор считает каждую клетку и одновременно, сортирует их по размерам. Количество сосчитанных прибором клеток значительно больше, чем при исследовании под микроскопом, вследствие чего повышается точность и уменьшается статистическая ошибка.

Разница в электрическом сопротивлении раствора и клеток используется в механизме их определения. Кровь разводится буферным раствором. Объем раствора протекает через апертуру 78 мкм в кювете RBC/PLT для эритроцитов и тромбоцитов и 100 мкм в кювете для лейкоцитов, пропуская при этом электрический ток. Клетка, проходя через апертуру, вытесняет раствор из чувствительной зоны, моментально увеличивая сопротивление пропорционально своему размеру. Прибор преобразует этот импульс и подсчитывает количество эритроцитов и лейкоцитов.

Для определения параметров, связанных с клеточным объемом (НСТ, MCV, MPV и тройная дифференцировка WBC), инструмент измеряет величину каждого импульса, вызванного прохождением клетки через апертуру. Компьютер подсчитывает MCV и умножает на RBC для определения гематокрита НСТ. Схематично простейший датчик клеток, содержащий исследуемый образец, изображен на рис. 2.1, где 1 – катод; 2 – электрохимическая ячейка; 3 – апертура; 4 – корпус апертуры; 5 – суспензия клеток; 6 – анод; 7 – к вакуумному насосу; 8 – прохождение потока клеток; 9 – апертура.

Рис. 2.1. Подсчет клеток крови импедансным методом (из фирменного описания прибора)

Изотонический дилюент представлен в виде затемненной области вместе с суспензированными клетками 5. Раствор содержит электролиты, такие, как NaCl, с известной электрической проводимостью. При активации генератора тока цепи счета клеток возникает электрический ток, причем частью цепи является электролитический раствор дилюента. В процессе счета, клетка проходит через рубиновую апертуру 3 со строго точными размерами отверстия под воздействием разряжения в направлении 7. При прохождении клетки через апертуру электролитный раствор частично вытесняется. Вытеснение изменяет полное электрическое сопротивление цепи и создает импульс тока (рис. 2.2). Количество и размер этих импульсов регистрируются счетчиком клеток.

Рис. 2.2. Электрические импульсы, создаваемые клетками (из фирменного описания прибора)

Важной чертой электрического импульса является связь его высоты с размером клетки. Более крупные частицы или клетки создают импульсы с более высокой амплитудой. К счастью, известные типы клеток попадают в известные категории по размеру, что дает возможность отличить один тип клеток от другого. Учитывая это, прибор способен отличать и раздельно подсчитывать эритроциты и тромбоциты в одном разведении одновременно.

Принятые нормальные клеточные диапазоны для дифференцировки клеток по размерам следующие:

- Лейкоциты (WBC): 120 – 1000 мкм³;

- Эритроциты (RBC): 85 – 95 мкм³;

- Тромбоциты (PLT): 2 – 30 мкм³.

На рис. 2.2 импульс а представляет тромбоцит, импульсы b и d – эритроциты, а импульс с может быть либо очень малым тромбоцитом, либо пылью или остатками клеточной мембраны. Для коррекции устанавливается порог (Threshold), ниже которого с не учитывается. Таким образом, инструмент отделяет импульсы, которые не являются настоящими клетками.

В то время как по размерам эритроциты и тромбоциты могут быть хорошо разделены, каждый тип клеток имеет свои границы размеров. Эритроциты распределяются по размеру, формируя почти колоколовидную кривую. Тромбоциты имеют нормальное логарифмическое распределение. При изображении обеих гистограмм одновременно базы обеих клеточных популяций почти соприкасаются или пересекаются.

Случается, что пересекающиеся кривые создают трудности и требуют дополнительных процедур для дифференцировки тромбоцитов и эритроцитов. Зная это, легко понять, что отличить по размеру эритроциты и лейкоциты еще труднее. Поэтому они подсчитываются отдельно в разных кюветах.

Лейкоциты подсчитываются из лизированного разведения в соотношении 1:250. Эритроциты и тромбоциты считаются при разведении в соотношении 1:37000, приготовленном из первичного лейкоцитарного разведения. После того как разведение для счета RBC/PLT приготовлено, лизирующий раствор добавляется в лейкоцитарное разведение для того чтобы разрушить оболочки эритроцитов и освободить гемоглобин. Поскольку, в норме, эритроциты не имеют ядра, разрушение клеточной оболочки приводит к тому, что эритроциты не влияют на подсчет лейкоцитов.

Предварительно разведенная кровь, в которой подсчитываются эритроциты, содержит, также лейкоциты и тромбоциты. Поскольку содержание красных клеток значительно превышает количество лейкоцитов, этим фактором пренебрегают и лейкоциты подсчитываются вместе с эритроцитами.