ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА МЕДИЧНОЇ ХІМІЇ

МОДУЛЬ №2

«Загальні закономірності метаболізму. Метаболізм вуглеводів, ліпідів, амінокислот та його регуляція»

Змістовий модуль № 6

«Ферменти та коферменти. Регуляція метаболізму»

Методичні вказівки

Одеса 2008

Актуальність вивчення змістового модулю

Хімічні процеси в живих організмах характеризується великою швидкістю, а також взаємозв’язком. Вони проходять впорядковано, взаємообумовлено і послідовно. Взаємозв’язок і планомірність хімічних процесів, а також швидкість їх здійснення обумовлені ферментами.

Ферменти /ензими/ - універсальні біологічні каталізатори і біорегулятори метаболізму на всіх рівнях організації живої матерії від найпростіших форм до багатоклітинних організмів. І.П. Павлов назвав ферменти ініціаторами життя. Тому ферменти являють собою центральну ланку біохімії. Шлях до пізнання механізмів фізіологічних, біохімічних, генетичних і імунологічних процесів життєдіяльності, а тим більш до керування цими процесами при допомозі спрямованої регуляції обміну (особливо в хворому організмі), проходить через вивчення ферментів.

Ферментний каталіз є важливою основою сучасної біотехнології. Вивчення, а також добування і використання ферментів як фізіологічно активних речовин, має значення не тільки для медицини, але і для ряду галузей народного господарства.

Необхідність вивчення біохімії ферментів при підготовці лікарів (медична ензимологія) визначається тим, що кожний патологічний процес, пов’язаний з порушеннями обміну речовин, і різноманітними змінами в каталітичній активності ферментів. Напрямок і швидкість реакції, накопичення і руйнування метаболітів визначається дією ферментів. Каталітична активність залежить від цілого ряду факторів (рН середовища, наявністі активаторів та інгібіторів, від температури та ін.). Знання властивостей ферментів, причин та наслідків змінення їх активності дозволяє характеризувати стан обміну речовин в організмі. Крім того, визначення активності ферментів в біологічних середовищах широко використовується в клініці для діагностики хвороб, крім того, багато ферментних препаратів використовується для лікування. Тому медична ензимологія включає ензимопатологію, ензимодіагностику і ензимотерапію.

Ензимопатологія – є обов’язковою ланкою загальної патології в патогенезі хвороб.

Ензимодіагностика – визначення активності ферментів, особливо їх ізоферментів, у крові, плазмі та ін. – являється дуже високоефективною та найбільш ранньою ознакою патології.

Ензимо- та коензимотерапія – використання ферментів, та коферментів з лікувальною метою. У медичній практиці використовуються також інгібітори ферментів. Необхідно відзначити, що на кафедрі медичної хімії ОДМУ широко використовуються різні коферменти для лікування променевої хвороби, як в експерименті, так і в клініці. Наприклад, такі коферменти, як НАД, ПАЛФ у комплексі з вітаміном Е, оротовою кислотою, АТФ, аденозіном благотворно впливають на перебіг хвороби у експериментальних тварин.

Мета вивчення змістового модулю

- Студент повинен ознайомитися з біологічною дією ферментів, їх основними властивостями, як біологічних каталізаторів.

- Засвоїти основні принципи визначення активності ферментів в біологічних об’єктах, вміти дати медико-біологічну оцінку результатам визначень при змінюванні ферментативної активності.

- Знати, що великий внесок у розвиток ферментології внесли вітчизняні та іноземні вчені М.М. Манасеїна, О.Н. Бах, А.Л. Данилевський, І.П. Павлов, В.І. Паладін, А.Є. Браунштейн, М.М. Шемякін, Л. Пастер, Є.Бюхнер, Д. Самнер, Д. Нортроп та ін.

- Усвідомити значення білків у процесах життєдіяльності, як основи структури живих організмів (структурні білки) та як основи обміну речовин (білки – біокаталізатори метаболізму, ферменти).

Зміст навчально – методичної розробки

№п/п	Тема заняття	К-сть год.
3	Тема 2. Загальна характеристика, властивості ферментів. Білкова природа ферментів. Міжнародна класифікація і номенклатура ферментів. Проферменти. Активація проферментів, роль у метаболізмі. Визначення структури ферментів біуретовою реакцією, реакцією Фоля. Визначення активності трипсину формолтитруванням гідролізатів білку	2
4	Тема 3. Активний, алостеричний центри ферментів. Регуляція активності ферментів. Активатори та інгібітори ферментів. Визначення активності амілази слини та сечі в присутності активатора та інгібітора	2
5	Тема 4. Коферменти, їх роль у каталізі. Коферментні функції вітамінів. Дослідження ролі піридоксальфосфату у каталітичній активності амінотрансферази	2
6	Тема 5. Основні теорії біокаталізу. Кінетика каталізу. Методи якісного і кількісного визначення ферментів. Спостереження кінетики дії ліпази на жир молока. Вплив жовчі на активність ліпази	2
7	Тема 6. Ізоферменти, Внутришньоклітинна локалізація ферментів. Використання ферментів у клініці (основи медичної ензимології). Ензимодіагностика, ензимотерапія. Ензимопатії. Демонстрація ензимограм.	2

Тема №. 2. Загальна характеристика, властивості ферментів. Білкова природа ферментів. Міжнародна класифікація і номенклатура ферментів. Проферменти. Активація проферментів, роль у метаболізмі (2 год).

Лабораторна робота 1. Визначення структури ферментів а) біуретовою реакцією,

б) реакцією Фоля

2. Визначення активності трипсину формолтитруванням гідролізатів білку

Мета заняття:

Студент повинен знати:

- хімічну природу ферментів, їх будову, біологічну роль та основні властивості білків як біокаталізаторів;

- типи хімічних реакцій, які закладені в основу Міжнародної класифікації ферментів і принципи їх номенклатури;

- характеристику окремих класів ферментів і дати приклади по кожному класу ферментів;

- значення чотирьохзначних шифрів ферментів;

- специфічність та види специфічності ферментів

Студент повинен вміти:

• визначити хімічну природу ферментів за допомогою реакцій на білки та амінокислоти

1. Матеріали методичного забезпечення теми

   0. Завдання для перевірки вихідного рівня знань, вмінь

1. Етапи розвитку вчення про ферменти

2. Роль вітчизняних вчених у ферментології

3. Хімічна природа ферментів

4. Докази хімічної структури ферментів

5. Типи зв’язку у структурі білків

6. Рівні структури у молекулах білків

7. Принципи виявлення білку у розчинах

8. Які основні типи хімічних реакцій відомі вам з курсу біоорганічної хімії

9. Для яких сполук характерні пептидні, складно-ефірні, глікозидні зв’язки

10. Хімізм біуретової реакції

11. Принцип реакції Фоля

1.2. Зміст лабораторної роботи

1. Виявлення структури ферменту за допомогою біуретової реакції

Принцип методу - відкриття пептидних зв’язків у білках та пептидах. Ці речовини у лужному середовищі утворюють з сульфатом міді комплекс, що має червоно-фіолетове забарвлення.

Хід роботи. В пробірку наливають 0,5 мл досліджуваного розчину, добавляють 0,5 мл 10% розчину NaOH і 1-2 краплі 1% розчину CuSO₄ і перемішують. За наявності білку з’являється червоно-фіолетове забарвлення.

2. Реакція Фоля на сірковмісні амінокислоти

Принцип методу – при кип’ячінні з лугами сірка, що відщіплюється від сірковмісних амінокислот, утворює сульфід натрію, який з ацетатом свинцю дає темний осад сульфіду свинцю.

Хід роботи. До 0,5 мл досліджуваного розчину додають 5-6 крапель 30% розчину NaOH і 1-2 краплі ацетату свинцю. Вміст пробірки кип’ятять. При позитивній реакції на сірку рідина у пробірці темніє.

3. Визначення активності трипсину формолтитруванням гідролізатів білку

Принцип методу – амінокислоти володіють амфотерними властивостями. Формальдегід, утворюючи метиленові похідні з амінокислотами, зв’язує аміногрупи, внаслідок чого карбоксильні групи амінокислот можуть бути від титровані лугами. Трипсин, гідролізуючи білки, збільшує кількість вільних амінокислот у розчині білку, що виявляється титрометрично.

Хід роботи. а) виявлення вмісту вільних амінокислот у розчині білку (контроль).

У конічну колбу з 5 мл розчину білку додати 5 мл розчину формальдегіду, 2-3 краплі розчину фенолфталеїну. Титрувати 0,1н NaOH до появи малинового забарвлення. Записати кількість мл лугу, що пішли на титрування.

б) проведення ферментативного гідролізу (дослід). У пробірку з 5 мл розчину білку додати 0,5 мл гомогенату підшлункової залози, що містить трипсин, та інкубувати на водяній бані 15 хв при 37⁰С. Перенести вміст пробірки у конічну колбу, додати 5 мл розчину формальдегіду, 2-3 краплі розчину фенолфталеїну. Титрувати 0,1н NaOH до появи малинового забарвлення. Записати кількість мл лугу, що пішли на титрування. Різниця кількості мл лугу між дослідом та контролем свідчить про накопичення вільних амінокислот у розчині білка. Оскільки 1 мл 0,1н NaOH відповідає 1,4 мг амінного азоту, то активність трипсину виражена:

А = (Д-К)х1,4х2 = мг амінного азоту за 15 хв інкубації на 1 мл гомогенату

Медико-біологічна оцінка отриманих результатів

Висновок 1: поява червоно-фіолетового забарвлення свідчить про наявність пептидних зв’язків у молекулі ферменту, тобто про його білкову природу.

Висновок 2: у структурі ферменту є сірковмісні амінокислоти.

Висновок 3: трипсин гідролізує пептидні зв’язку у білках, внаслідок чого збільшується кількість вільних амінокислот, що визначається формолтитруванням.

3. Запитання для перевірки кінцевого рівня знань

1. Спільне і розбіжне у будові простих і складних ферментів

2. Хімічна природа кофактору, апоферменту, холоферменту

3. Основні принципи, що лежать в основі Міжнародної класифікації та номенклатури ферментів

4. Характеристика окремих класів ферментів і типів хімічних реакцій за Міжнародною класифікацією.

5. Підкласи ферментів, їх значення у класифікації

6. Принцип побудови назви ферменту. Тривіальна номенклатура.

7. Який зміст має чотиризначний шифр ферментів. Приклади

8. Тип реакцій, що каталізюють оксидоредуктази. Назвіть відомі вам дегідрогенази, оксидази, пероксидази

9. Тип реакцій, що каталізують трансферази. Дайте приклади реакцій, що каталізують амінотрансферази

10. Реакції, що перебігають за участю гідролаз, ліаз, ізомераз, синтетаз.

11. Термолабільність та оптимум рН у дії ферментів

12. Специфічність. Види специфічності

13. Проферменти. Шляхи перетворення проферментів у ферменти

1.4 Тестові завдання до теми (вибрати з тестових завдань до модульного контролю)

1.5 Теми для самостійної роботи студентів

1. Активація проферментів шлунково-кишкового тракту, її роль у перетравлюванні їжі

2. Біологічне значення низької специфічності ферментів шлунково-кишкового тракту

Наступна тема 3. Активний, алостеричний центри ферментів. Регуляція активності ферментів. Активатори та інгібітори ферментів.