- •Биохимия Методические указания к лабораторным работам для студентов очной формы обучения по специальности 070100 – «Биотехнология»
- •Составители: л.В. Аникина, л.С. Пан, г.А. Козлова
- •Введение
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Порядок работы в лаборатории
- •Оформление лабораторной работы
- •Раздел I. Ферменты Лабораторная работа №1
- •Лабораторная работа № 2
- •Лабораторная работа №3
- •1. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
- •2. Специфичность действия амилазы и сахаразы.
- •3. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны.
- •4. Определение оптимума рН активности амилазы
- •Раздел II. Витамины Лабораторная работа №4
- •5. Обнаружение рибофлавина (витамина в2).
- •6. Качественная реакция на никотинамид (витамин рр).
- •7. Качественная реакция на пиридоксин (витамин в6).
- •8. Качественная реакция на аскорбиновую кислоту (витамин с).
- •9. Качественная реакция на рутин (витамин р).
- •Лабораторная работа №5
- •Лабораторная работа №6
- •Лабораторная работа №7
- •Лабораторная работа №8
- •Раздел III. Обмен веществ Лабораторная работа №9
- •Лабораторная работа №10
- •Лабораторная работа №11
- •1. Построение калибровочного графика
- •2. Определение фосфора в культуральной жидкости
- •Лабораторная работа №12 качественные реакции на некоторые составные части молока
- •Литература
Лабораторная работа №6
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РУТИНА В ЧАЕ
Цель работы – приобрести навыки количественного определения витамина Р в чае.
В основе витамина Р лежит ядро флавона. Известно несколько соединений, обладающих Р-витаминным действием. Рутин (рутозид) – это гликозид флавона кверцитина и дисахарида рутинозы (глюкоза и рамноза).
флавон рутин
Рутин – кристаллическое вещество желто-оранжевой окраски. Содержится в тех же продуктах, что и витамин С. В чае содержится 30-50 мг% рутина, в зеленом чае – несколько больше.
Метод основан на способности рутина окисляться перманганатом калия. В качестве индикатора используется индигокармин, который вступает в реакцию с калия перманганатом после того, как окислится весь рутин.
Материал исследования: черный или зеленый чай.
Реактивы: 0,05 н. раствор перманганата калия; индикатор индигокармин.
Оборудование: весы с разновесом; конические колбочки на 50 мл; водяная баня; воронка с фильтром; пипетка на 10 мл; мерная колба на 50 мл; микробюретка для титрования.
Ход работы: В коническую колбу к 0,1 г чая приливают 40 мл горячей воды и проводят экстракцию при нагревании на водяной бане в течение 5 минут. Далее раствор фильтруют в мерную колбу на 50 мл и доводят водой до метки дистиллированной водой. Для титрования пипеткой отмеривают в колбу для титрования 10 мл экстракта, добавляют 10 мл дистиллированной воды и 5 капель индигокармина, при этом появляется синее окрашивание. Титруют из микробюретки раствором KMnO4 до появления устойчивой желтой окраски.
Указания к составлению отчета: Расчет проводят по формуле:
Х = (0,0032 ∙ V ∙ 50 ∙ 1000)/(10 ∙ 0,1),
где Х – содержание рутина, мг/кг,
0,0032 – титр рутина по 0,05 р. раствору KMnO4, мг/мл,
50 – разведение (объем мерной колбы), мл,
1000 – коэффициент пересчета на 1 кг сырья, г,
10 – объем жидкости взятый для титрования, мл,
V – объем KMnO4, пошедший на титрование, мл,
а – навеска исследуемого материала, г.
Лабораторная работа №7
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В1
Цель работы: освоить метод количественного определения тиамина флюорометрическим методом по Вангу и Харрису.
Витамин В1 в щелочной среде под действием гексоциано-Ш-феррата калия окисляется в тиохром — пигмент желтого цвета, который в изобутиловом спирте дает интенсивно синюю флюоресценцию:
Определение основано на окислении тиамина в тиохром, экстракции тиохрома органическим растворителем и измерении интенсивности голубой флюоресценции. Для количественного определения тиамина сравнивают флюоресценцию окисленных стандартных и испытуемых растворов тиамина хлорида на флюорометре.
Исследуемый материал: раствор тиамина хлорида.
Реактивы: 10% раствор гексациано-(III)-феррата калия; 20% раствор гидроксида натрия; рабочий стандартный раствор тиамина (10 мкг в 1 мл); этанол; изобутанол.
Оборудование: флюорометр с фотокюветами из кварцевого стекла, штатив с пробирками, пипетки, пять делительных воронок.
Ход работы. В делительную воронку наливают 6—8 мл пробы, прибавляют равный объем изобутанола и встряхивают в течение 2 мин. Промытую пробу (нижний слой) сливают в две сухие делительные воронки (по 2 мл) и прибавляют по 1 мл раствора гидроксида натрия.
В опытную воронку по каплям вносят свежеприготовленный раствор гексациано-(Ш)-феррата калия до тех пор, пока окраска не сохранится в течение 30 с. В опытную и контрольную воронки прибавляют по 5 мл дистиллированной воды, по 10 мл изобутанола и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. Нижний слой пробы сливают, а верхний (изобутанол) собирают в две сухие пронумерованные пробирки.
В третью делительную воронку вносят 1 мл рабочего стандартного раствора тиамина и 1 мл воды, в четвертую — 2 мл дистиллированной воды. В обе воронки прибавляют по 1 мл раствора гидроксида натрия, по 10 капель раствора гексациано-(Ш)-феррата калия, встряхивают, доливают по 5 мл воды, и по 10 мл изобутанола, снова встряхивают в течение 2 мин. Нижний слой удаляют, а верхний собирают в две сухие пронумерованные пробирки.
Для просветления растворов во все четыре пробирки — опытную, стандартную и две контрольные добавляют по 2 мл этанола. Проводят сравнение интенсивности флюоресценции исследуемой пробы и контроля. Содержание тиамина определяют на флюорометре по флюоресценции тиохрома.
Указание к составлению отчета.
Массовую концентрацию тиамина (мкг) в исследуемом материале находят по формуле:
X=С(ЕОП-Ек)V0/ЕСТV1,
где Х – массовая концентрация тиамина в пробе, мкг;
С – концентрация тиамина в 1 мл рабочего стандартного раствора (10 мкг);
V1 – объем пробы, взятой для анализа (2 мл);
V0 – общий объем пробы (мл);
Еоп – интенсивность флюоросценции опытной пробы;
Ек – интенсивность флюоресценции контрольной пробы;
Ест – интенсивность флюоресценции стандартной пробы.