Лабораторная работа №10

ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

Цель работы – ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения основного показателя углеводного обмена - глюкозы.

Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает сине-зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре.

Исследуемые материалы: культуральная жидкость.

Реактивы: 3% раствор трихлоруксусной кислоты; ортотолуидиновый реактив (0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл перегнанного ортотолуидина; хранят в темной склянке); стандартный 0,1% раствор глюкозы.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; штатив с пробирками, водяная баня, пипетки.

Ход работы.

а) Осаждение белков. В две центрифужные пробирки наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл культуральной жидкости, а в другую - 0,1 мл стандартного раствора глюкозы. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

б) Цветная реакция с ортотолуидиновым реактивом. 0,5 мл надосадочной жидкости из каждой пробирки вносят в обычные сухие пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную баню (100^оС) на 8 минут (время инкубации проб и температурный режим необходимо соблюдать точно, кроме того, обязательным условием для нормального протекания данной реакции является непрерывное кипение воды в бане). По истечении времени пробирки вынимают и охлаждают в водопроводной воде до комнатной температуры.

в) Измерение оптической плотности растворов. Оптическую плотность проб измеряют на фотоэлектроколориметре в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм).

Указания к составлению отчета.

Содержание глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:

С_оп = (С_ст ^. Е_оп) / Е_ст,

где C_оп - концентрация глюкозы в пробе, ммоль/л,

C_ст - концентрация глюкозы в стандартной пробе, 5,55 ммоль/л,

Е_оп. - оптическая плотность исследуемой пробы,

Е_ст - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

Лабораторная работа №11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

Цель работы – ознакомиться с колориметрическим методом определения неорганического фосфора в культуральной жидкости.

Неорганический фосфор биологических жидкостей входит в состав солей фосфорной кислоты. Основное назначение солей фосфорной кислоты в биологических жидкостях - создание в них буферной системы. Неорганический фосфат взаимодействует с молибдатом аммония в присутствии восстановителей (например, аскорбиновой кислоты) с образованием окрашенного комплексного соединения (молибденовой сини). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации неорганического фосфата.

Исследуемые материалы: культуральная жидкость.

Реактивы: 10% раствор трихлоруксусной кислоты; молибденовый реактив (см. работу №9); 1% раствор аскорбиновой кислоты на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г КН₂РО₄, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочного графика).

Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; штатив с пробирками, пипетки.

Ход работы.