11. Индикация, выделение и идентификация вирусов.

В лаборатории часть материала берут для исследования, оставшуюся часть хранят на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследования присланного материала, которые включапет следующие задачи:

• Обнаружение ( индикация) вируса в материале;

• выделение ( изоляция) вируса из материала;

• идентификация выделенного вируса;

• при необходимости требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса;

• ретроспективная диагностика.

Методы обнаружения вирусов в материале от больных животных и трупов. Для обнаружения вируса чаще всего используют экспресс-методы, которые позволяют в материале: 

1. обнаружить вирусные белки (антигены), для этой цели используют серологические реакции: РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП;

2. обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ДНК-зонда;

3. обнаружить вирионы вирусов. Электронная микроскопия позволяет обнаружить вирусы любых размеров, а крупные вирусы (вирусы оспы) можно увидеть под световым микроскопом. Этот метод называется вирусоскопия.

Электроная микроскопия используется в основном в исследовательских целях. Электронный микроскоп - сложный и дорогой прибор, в диагностических ветеринарных лабораториях его нет. Хотя исследование с его помощью-очень эффективный экспресс-метод при диагностике рота-, коронавирусных и других инфекций. Если в материале содержится не менее 10-7 вирионов на 1мл, он не требует дополнительных методов очистки концентрации; 4. Обнаружить тельца - включения под световым или люминесцентным микроскопом. Тельца-включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках при репродукции в них некоторых вирусов. По природе они представляют собой либо скопления (колонии) вирионов, либо измененный под депйствием вируса клеточный материал, либо комбинацию первого со вторым. Тельца-включения могут находиться в цитоплазме ( чаще это РНК- содержащие вирусы) или в ядре (чаще это ДНК-содержащие вирусы, кроме вируса оспы), или в цитоплазме и ядре клетки (вирус чумы собак). Тельца-включения, образуемые некоторыми вирусами, получили специальное название, так, тельца-включения при оспе кур называются тельцами Боллингера, при чуме плотоядных - Ленца, при бешенстве Бебеша-Негри и др. При обнаружении телец Бебеша-Негри в мазках головного мозга погибшего животного наличие бешенства считается доказанным. При других вирусных инфекциях обнаружение телец-включений имеет лишь вспомогательное диагностическое значение; 5. обнаружить вирусные гемагглютинины, которые являются белками некоторых вирусов (орто-, парамиксовирусов и др). Гемагглютинирующие вирусы способны аггютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температуры и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале ; 6. для обнаружения вируса в активной форме (инфекционной) используют довольно длительные вирусологические исследования. С этой целью применяют метод биопробы на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток. В редких случаях приходится использовать естественно восприимчивых животных. Методы выделения вирусов из материала больных животных и трупов.  Выделение вируса из исследованного материала - самый важный этап в диагностике вирусных болезней. Его проводят на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: на животных: куриных эмбрионах и культурах клеток. Для заражения чувствительных систем из материала (кусочки органов и тканей) готовят суспензию. С этой целью материал измельчают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком, разводят стерильным физиологическим раствором или растворомХенкса (1:5-1:10), освобождают от крупных частиц путем центрифугирования в течении 20-30 мин.при 2000-3000 мин-1. За тем суспензию освобождают от бактерий и грибов, используя для этой цели антибиотики ( обычно смесь пенициллина стрептомицина по 200-1000 ЕД на 1 мл жидкости и нистатина), или пропускают через бактериальные фильтры (редко). Контролируют эффективность такой обработки посевом на питательные среды для аэробов, анаэробов и грибов. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения живых объектов. Смывы для заражения готовят следующим образом. Тампоны, погруженные в специальный раствор, встряхивают 10-15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют при 2000-3000 мин-1 20 мин. Недостаточную жидкость отсасывают в стерильные пробирки, обробатывают антибиотиками и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ. Полученной таким образом суспензией заражают чувствительные к предполагаемому вирусу живые объекты (животных, куриные эмбрионы, культуры клеток,) и регестрирует появления у них признаков размножения вируса, что служит показателем наличия вируса в исследуемом материале. Однако вирус не всегда проявляет действие в первом пассаже. В этом случае необходимо прровести 3-4 “пассажа”, чтобы вирус адаптировался к используемому живому объекту и накопился в количестве, достаточном для проявления своего действия. Выделение вируса на культуре клеток. Культуры клеток пригодны для выделения большинства вирусов животных. Для этой цели используют как первично-трипсинизированные, так и перевиваемые и диплоидные культуры клеток. Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из пробирок или матрасов выросшим монослоем клеток удаляют ростовую питательную среду, отмывают монослой клеток от ростовой среды ( в ней могут быть антитела к исследуемому вирусу и неспецифические ингибиторы) раствором Хекса и вносят вируссодержащий материал. После контакта ( 1-1,5 ч) , необходимого для адсобции вируса на клетках, вирусосодержащий материал удаляют и вносят поддерживаюую питательную среду, которая не способствует размножению клеток, не обеспечивает их жизнедеятельности. Пробирки и матрасы помещают в термостат для инкубации. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки, репродуцируются в них и выводят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, затем следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток. Обнаружить вирус в клетках можно следующими методами (или признаками): 1)по цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическому эффекту (ЦПЭ). ЦПД- это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД могут быть вемьма разнообраными, что зависит от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 суток после заражения (энтеровирусы), другие- 1-2 нед. (аденовирусы). Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление клеток, симпластообразование . Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везткулярного стоматита др.) Округление - клетки принимаю шаровидную форму и отделяются от стекла ( адено-, пикорнавирусы и др.) Симпластобразование - образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается в следствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами( вирус ПГ-3, чумы крупноо рогатого скота и др.); 2) с ее помощью в культуре клеток можно обнаружить некоторые вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами: вирусы ПГ-3, гриппа и др. реакцией гемадсорбции. Гемадсорбцией называется прилипание (адсорбция ) эритроцитов крови на поверхности клеток, зараженных вирусом. Этот метод широко используется при диагностике П-3 крупного рогатого скота, при этом используют эритроциты морской свики (цв.вкл.,рис.19); 3) методом образования “бляшек”. Этот метод технически сложнее других и применяется главным образом для титрования и клонирования вирусов; 4) обнаружение вируса в РИФ. В том случае, если размножение вирусов в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить при помощи флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при дианостике классической чумы свиней, парвовирусных инфекций, бешенства и др.; 5) иммунопероксидазной реакцией; 6) путем обнаружения внутриклеточных включений. Для выявления телец-включений культуру клеток выращивают на покровных стеклах, помещенных в пробирки, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации (при 37°С), стекла промывают, фиксируют и окрашивают различными методами (гематоксилин-эозином, акридиновым оранжевым и др.). Размножающиеся в культурах клеток вирусы частично или полностью ( в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культурную жидкость, которая и используется как готовая суспензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса, то их разрушают путем 2-3- кратного замораживания и оттаивания или ультразвуком. Выделение вируса на куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы чувствительны к большинсту вирусов птиц и к некоторым вирусам млекопитающих (болезни Ньюкасла, гриппа, оспы птиц, ПГ-3 др.). Используют куриные эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого зародыша, хорионаллантоисной (ХАО) и амниотической оболочках, в стенках желточного мешка, накакапливается в этих структурах и в жидкостях аллантоисной и амниотической полостей. В разных структурах могут репродуцироваться различные вирусы. Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют слудующие методы:

• на ХАО- например, вирусы оспы птиц и др.;

• в аллантоисную полость- вирусы гриппа, ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус болезни Ньюкасла и др.;

• в амниотическую полость- вирусы риппа;

• в желточный мешок- вирус ринопневмании лошадей.

В редких случаях используют метод заражения куриных эмбрионов в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Обнаружить вирус в куриных эмбрионах можно по следующим признакам:

• по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации;

• по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и друих инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т.п.;

• по реакции гемагглютинации ( для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа,ПГ-З и др.) При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриога через 3-7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвести эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация) . Так, для выявления вируса ПГ-3 крупного рогатого скота используют эритроциты морской свинки, вирусов гриппа- эритроциты кур и т.д.

Выделение вируса на лабораторных животных. Для этой цели чаще всего используют белых мышей, белых крыс, золотистых хомячков, морских свинок, кроликов и др. Существует большое количество методов введения инфекционного материала лабораторным животным. Наиболее часто используют внутримышечное, подкожное, внутривенное, интраназальное и интрацеребральное введение, Выбор метода заражения зависит от тропизма исследуемого вируса и вида жиаотного. За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменения их поведения, появление специфических признаков болезни( так, вирус болезни Ауески у кроликов вызывает зуд, расчесы в месте инъекции вирусного материала, затем паралич и гибель животного). Материал для вирусологических исследований от лабораторных животных следует брать как можно быстрее после появления четких специфических признаков болезни или после их гибели ( так, при выявлении вируса ящура на новорожденных мышатах их убивают в агональной стадии и используют скелетные мышцы для приготовления антигена в РСК). Признаками размножения вируса в организме лабораторных животных после эксперементального заражения служат гибель, клинические симптомы болезни и патологические изменения ( устанавливают при вскрытии). Если зараженное живвотное пало, его немедленно вскрывают, а если не погибло, убивают ( через соответствующий срок) и тоже вскрывают для обнаружения патологоанатомических изменений, взятия вируссодержащего материала и дальнейшего исследвания или следующего пассажа. Использованных животных обезвреживают автоклавированием или сжиганием в специальной печи. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ НА ЕСТЕСТВЕННО ВОСПРИИМЧИВЫХ ЖИВОТНЫХ.  Используют редко и только в случаях, когда нет возможности использовать лабораторные чувствительные живые системы (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторных животных). Методы идентификации выделенных вирусов. Выделенный вирус необходимо идентифицировать, т.е. установить, какой это вирус ( семейство, род, вид). Идентификацию неизвестного ( выделенного) вируса проводят с помощью серологических реакций: РТГА, РТГАд, РН, РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП, и др. При этом выделенный вирус используют как антиген и с ним в серологических реакциях применяют специфические сыворотки, содержащие антитела к заведомо известным вирусам. Та сыворотка, с которой выделенный вирус будет давать продолжительную реакцию ( образование комплекса антиген+ антитело) и укажет, какой это вирус. Важно правильно выбирать серологическую реакцию. Каждая лаборатория предпочитает те или иные методы, основываясь на чувствительности, специфичности, скорости. Удобствах и стоимости. Так, если вирус выделели на культуре клеток и он дает гемадсорбацию, то проще и быстрее его идентифицировать в РТГАд. Например, вирус ПГ-3 крупного рогатого скота дает гемадсорбцию с эритроцитами морской свинки и может быть идентифицирован в РТГАд. Вирусы, обладающие гемагглютинирующей активностью, целесообразно идентифицировать в РТГА. Для идентификации выделенных вирусов используют РИФ, ИФА, РНГА, РДП, ПСК. Наиболее универсальной и дающей более достоверные результаты при идентификации выделенных вирусов является РН, в которой используют теже живые чувствительные системы, на которых и был выделен исследуемый вирус. Применение моноклональных антител с определенной специфичностью прозволяет проводить идентификацию многих вирусов до уровня подтипов, штаммов или вариантов. Для обнаружения и идентификации вирусов кроме серологических реакций используют прямые методы идентификации вирусных нуклеиновых кислот: ДНК-зонды, полимеразную цкпную реакцию (ПЦР). С их помощью выявляют нуклеиновые кислоты вирусов. Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислот- способности односпиральных комплементарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплементарными молекулами вида : ДНК+ДНК,ДНК+РНК,РНК+РНК. Геном вирусов, представленный в виде специфической последоватедльности нуклеидов в молекулах нуклеиновых кислот, наиболее информативен и является надежным критерием для идентификации. У большинства ДНК- содержащих вирусов (адено-,герпес-, покс-,папилломавирусы и др.) нуклеиновая кислота находится в виде двух цепей, которые связаны ( водородная связь) комплементарно через азотистые основания ( аденин-тимин,гуанин-цитозин).