- •Ветеринарная вирусология, ее достижения и задачи.
- •Вирионы - наиболее известная форма существования вирусов.
- •Вирусы как инфекционные агенты. Принципиальные отличия вирусов от других инфекционных агентов.
- •Генетические признаки вирусов и их использование в характеристике штаммов. Мутации у вирусов и их механизмы.
- •Действие на вирионы вирусов различных температур, уфл, кислот, щелочей, спиртов, дезинфектантов, окислителей и восстановителей, жирорастворителей, антибиотиков.
- •Диагноз на основе анализа клинических симптомов, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных.
- •18. Инактивированные вакцины.
- •19. Живые вакцины.
- •Значение вирусов для решения общебиологических проблем.
- •Индикация вирусов в патологическом материале по обнаружению вирионов и вирусных телец-включений.
- •Индикация, выделение и идентификация вирусов.
- •Обнаружение ( индикация) вируса в материале;
- •Иммуноферментный анализ. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Использование в вирусологии лабораторных животных. Устройство вивариев, правила техники безопасности при работе с лабораторными животными.
- •Масса животных в разном возрасте
- •Температура тела, пульс и число дыханий у здоровых животных
- •Состав крови некоторых лабораторных животных (по в.Н.Никитину)
- •Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток. Получение клеточных культур.
- •Клеточный геном и реализация генетической информации в нормальной клетке.
- •Клеточный и гуморальный противовирусный иммунитет, их взаимодействие.
- •Принципы культивирования вирусов.
- •Методика титрования и расчёта титра вируса в оое и бое, в единицах 50%-го инфекционного действия.
- •Методы уничтожения, инактивации и консервации вирусов.
- •Механизм персистенции вирусов в клетках.
- •Неспецифические факторы противовирусной защиты организма.
- •Окончательный диагноз на основе обнаружения и идентификации вирусов в организме больных животных.
- •Обнаружение ( индикация) вируса в материале;
- •Особенности противовирусного иммунитета.
- •Открытие вирусов и история их изучения.
- •Патогенез вирусных болезней животных.
- •Персистенция вирусов. Роль факторов иммунитета на этапах патогенеза вирусной болезни.
- •Получение патологического материала, его транспортировка.
- •2.1 Получение и обработка патологического материала
- •2.2 Получение патологоанатомического материала
- •2.3 Получение проб для гистологического исследования.
- •2.4 Транспортировка и хранение проб.
- •Понятие о титре вируса. Единицы количества вируса: оое, бое, лд, ид, элд, эид, цпд, гае. Выражение в них титра вирусов.
- •Понятия о гене и геноме вирусов. Вирусная популяция, вирусный штамм, вирусный клон.
- •Правила работы с вируссодержащими материалами.
- •1.1 Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом
- •Получение и транспортировка патологического материала для вирусологических исследований.
- •Устройство вирусологической лаборатории.
- •Превращение вирусологии в одну из фундаментальных биологических наук.
- •Принципы диагностики вирусных болезней животных.
- •Природа вирусов, их место и роль в биосфере. Роль вирусов в эволюции жизни на Земле.
- •Вирусы играют эволюционную роль.
- •Пути проникновения вирусов в организм животного. Первичная локализация и циркуляция вируса.
- •Вторичная циркуляция вируса. Механизм повреждающего действия вирусов на клетки.
- •Полимеразная цепная реакция, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реконвалесценция, вирусоносительство и вирусовыделение.
- •Репродукция вирионов вирусов.
- •Реакция иммунной флуоресценции, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция нейтрализации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция непрямой гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Роль вирусов в инфекционной патологии животных, растений и человека.
- •Реакция связывания комплемента, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция торможения гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Использование в вирусологии реакции гемадсорбции.
- •Серологическая диагностика вирусных болезней по приросту титра антител в парных сыворотках крови.
- •Систематика вирусов. Принцип систематики, ее научная и практическая ценность.
- •Основные критерии таксономической классификации вирусов
- •Специфическая профилактика вирусных болезней животных.
- •Специфические факторы противовирусного иммунитета и их формирование.
- •Структура и химический состав вирионов вирусов.
- •Типы вирусных геномов. Структурные (вирионные) и неструктурные белки вирусов, их свойства и отличия от клеточных белков, их функции.
- •Вирусные геномы. Виды вирусных геномов.
- •Трансляция и образование структурных и неструктурных вирусных белков. Сборка вирионов и их выход из клеток.
- •Титрование вирусов.
- •Ферменты вирионов, липиды и углеводы в составе вирионов.
- •3.1. Белки вирусов
- •3.2. Липиды вирусов
- •3.3. Углеводы вирусов
- •Формы взаимодействия вирионов с клетками.
- •Формы и размеры вирионов. Типы симметрии вирионов и их обусловленность. Нуклеиновые кислоты вирусов, их функции и отличия от клеточных нуклеиновых кислот.
- •Экономический ущерб, наносимый животноводству вирусными болезнями животных.
- •Вирусы гриппа птиц и ньюкаслской болезни и их дифференциация в ртга.
- •Вирус африканской чумы однокопытных.
- •Вирус африканской чумы свиней.
- •Вирус болезни Ауески.
- •Вирус болезни Тешена.
- •Вирус инфекционного бронхита кур.
- •Вирус инфекционного бурсита кур.
- •Вирус контагиозного пустулезного дерматита овец и коз.
- •Вирус чумы крупного рогатого скота.
- •1. Определение болезни
- •3. Возбудитель болезни
- •4. Эпизоотология
- •5. Патогенез
- •6.Течение и клиническое проявление
- •7. Патологоанатомические признаки
- •8. Диагностика и дифференциальная диагностика
- •9. Иммунитет, специфическая профилактика
- •10. Профилактика
- •11. Лечение
- •12. Меры борьбы
- •Вирусы гриппа.
- •1. Грипп птиц.
- •2. Грипп свиней.
- •3. Грипп лошадей.
- •Вирусы энцефаломиелитов лошадей.
- •Вирус миксоматоза кроликов.
- •Вирус геморрагической болезни кроликов.
- •Прионы и прионные инфекции животных.
- •6.1. Общая характеристика прионов и прионных инфекций
- •6.1. Основные различия нормальной и патогенной форм прионного белка
- •6.2. Прионные инфекции животных
- •6.3. Скрепи
- •6.4. Энцефалопатия норок
- •Медленные вирусные инфекции.
- •Вирус Алеутской болезни норок.
- •Вирус чумы плотоядных.
- •Вирус инфекционной анемии лошадей.
- •Вирус парагриппа-3.
- •Аденовирусы крупного рогатого скота.
- •Вирусы лейкозов.
- •Вирус болезни Марека.
- •Вирусы респираторно-репродуктивного синдрома свиней и парвовирусной инфекции свиней.
- •Парвовирусная инфекция свиней
- •Вирус бешенства.
- •Лабораторная диагностика бешенства.
- •Лабораторная диагностика лейкоза крс.
- •5.6. Число лейкоцитов и лимфоцитов у здорового, подозрительного по заболеванию и больного лейкозом крупного рогатого скота («лейкозный ключ»)
- •Лабораторная диагностика оспы.
- •Лабораторная диагностика ящура.
Методика титрования и расчёта титра вируса в оое и бое, в единицах 50%-го инфекционного действия.
Титр – это количество вируса, содержащегося в единице объема материала. Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки и оспины на ХАО КЭ. Если имеются данные обратные то инфекционная активность вируса может быть измерена в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ) 1БОЕ = дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ – одной оспины. Методы: заражают несколько КК или КЭ на ХАО. Высчитывают среднеарифметическое количество оспин или бляшек. Оно = БОЕ или ООЕ вируса. Рассчитывают сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вируссодержащего материала. Это и есть титр. Т=n/Va, где n-сред арифметическое бляшек или оспин, а –разведение материала, V – введенная доза. Метод 50%-ного инфекционного действия. За единицу количества вируса принимается доза, которая способна вызвать инфекционный эффект у 50% зараженных. Число таких доз в единице материала и будет выражать титр вируса в этом материале. Готовят 10 кратное разведение исследуемого материала, затем одинаковыми дозами заражают равные группы живых тест объектов. Учитывают результат действия и находят в каком разведение вирус проявил свое действие на 50%. Если сразу такое разведение не найдено то оно рассчитывается по формуле Т=lgB – (b-50)/(b-a) *lgd, где В – разведение дающие инфекционный эффект более 50%, b – процент дающий инфекционный эффект более 50%, а – менее 50% d – кратность разведения. За 1ГАЕ принимается такая доза вируса, которая способна агглютинировать примерно 50% эритроцитов содержащихся в том же, что и вирус объеме 1% суспензии отмытых эритроцитов. Готовят ряд последовательных кратных разведений материала и к каждому разведению добавляют 1% суспензию. Реакция оценивается в крестах. Реакция с 2 крестами содержит 1ГАЕ, которая умножается на кратность разведения.
Методы уничтожения, инактивации и консервации вирусов.
В промышленное производство вирусных препаратов с нарастающей скоростью вовлекаются все новые и новые вирусные агенты. Подавляющее большинство новых объектов относится к классу так называемых «оболочечных вирусов». Наблюдается тенденция быстрого сокращения периода между открытием очередного возбудителя и организацией лабораторных и промышленных производств инактивированных препаратов.
Требования по безопасности ужесточаются в связи с необходимостью во многих случаях приготовления концентратов вирусных антигенов. Следует отметить, что инактивация должна быть не только эффективной, но и максимально щадящей (селективной). Иными словами, сопутствующие изменения в структуре вирусных частиц и их компонентов должны быть минимальными. Однако механизм инактивирующих воздействий во многих отношениях недостаточно выяснен и их использование зачастую носит эмпирический характер.
Так как вирионы в центре агрегатов, образованных клеточными и сывороточными компонентами, могут быть защищены от инактивации, разрушение и удаление агрегатов различными методами очистки вирусной суспензии является важным этапом перед инактивацией. При изготовлении цельновирионных не-реплицирующихся вакцин используют химические и физические методы инактивации вирусов.
Химические методы инактивации вирусов
Из химических соединений наиболее часто используют два главных типа инактиваторов: ретикулирующие (разрыхляющие) агенты и алкилирующие агенты.
К ретикулирующим агентам относятся альдегиды, в том числе формальдегид, глютаральдегид и глицидальдегид, из которых наиболее часто используют формальдегид. К алкирующим агентам относятся бетапропиолактон, этиленимин и другие азиридины.
Механизм действия инактивирующих агентов, вероятно, заключается в следующем: 1) взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, они делают невозможной их репликацию; 2) вызывают ретикуляцию белков.
Механизм действия инактивирующих агентов лучше изучен применительно к белкам, чем к нуклеиновым кислотам, хотя в целом остается не полностью выясненным. Инактивация вирусов, кажется, основывается на двойном действии ретикуляции белков, взаимодействующих с клеточными рецепторами, и блокаде репликации нуклеиновых кислот. Необходимая концентрация инактивирующих агентов зависит, главным образом, от относительной концентрации белков и нуклеиновых кислот в инактивируемой среде. Температура и гомогенность инактивируемого субстрата также играют ключевую роль в кинетике инактивации вируса.
Возможность обратимости изменений реактивных групп (аминогруппа лизина, фенольные ядра тирозина) необходимо учитывать, особенно в случае использования формальдегида.
Полнота инактивации вируса должна определяться сразу после изготовления вакцины.
Наиболее общепринятыми инактивирующими агентами являются формальдегид, бета-пропиолактон и этиленимин. Одним из преимуществ бета-пропиолактона, используемого для изготовления вакцины против бешенства, и этиленимина, применяемого в изготовлении вакцины против ящура, является то, что они полностью гидролизуются в течение нескольких часов с образованием нетоксичных продуктов.
Формальдегид инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.
Механизм инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает, соответственно, по типу реакции первого и второго порядка. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.
Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.
Формальдегид с большей скоростью взаимодействует с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метилольных производных, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид реагирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или иминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метилольные производные, а затем, в результате вторичных реакций — бисметиленовые производные.
Продукты взаимодействия формальдегида с аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид.
Во второй стадии происходит медленное взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов. При этом уплотняется белковая оболочка и уменьшается ее проницаемость. Вследствие этого снижается скорость инактивации вируса. Под влиянием формальдегида в вирионах клещевого энцефалита образовывались гликопротеиновые димеры и комплекс РНК с белками нуклеокапсида. Последний отличался высокой стабильностью и разрушался только РНКазой. Предполагается, что образование этого комплекса — основной механизм инактивации вируса. Гликопротеин, экстрагированный из инактивированного вируса, обладал нормальной антигенной и иммуногенной активностью.
Следует отметить, что реакция формальдегида с аминогруппами обратима, то есть при удалении избытка реагента или разбавлении раствора активность нуклеиновой кислоты может быть восстановлена. Процесс взаимодействия вируса с формальдегидом зависит от таких факторов, как концентрация реагента, температура, рН среды.
При оптимальных условиях инактивации взаимодействие формальдегида с белками многих вирусов не оказывает значительного влияния на их антигенные свойства. Однако ряд вирусов теряет значительную часть антигенной активности при инактивации формалином. Это особенно касается оболочечных вирусов и, прежде всего, вирусов кори и респираторно-синцитиального (PC) вируса. Например, инактивирован-ная формалином вакцина против PC-вируса вызывала образование антител к белку F, которые не подавляли его инфекционную и симпластообразующую активность. Более того, вакцинация приводила к осложнению течения болезни при последующем ее возникновении. Вероятно, под действием формалина изменяются эпитопы гликопротеина, ответственные за индукцию вируснейтрализующих антител.
Это касается, прежде всего, поверхностного F белка, ответственного за протективный иммунитет. Однако многие из вирусов, которые относительно хорошо переносят инактивацию формалином, оказываются весьма чувствительными к изменениям ее условий. Повышение концентрации формальдегида в десять и более раз по сравнению с оптимальной (0,1%-ной) приводило к морфологическим изменениям поверхностного антигена вируса гепатита В и снижению его активности, а увеличение продолжительности обработки очищенного полиовируса сопровождалось значительным повреждением капсида некоторых вирионов. С целью смягчения повреждающего действия формальдегида на антигенность и иммуногенность вирусов стали применять стабилизирующие вещества. Установлено, например, что добавление арилдона (5,4 М) не влияет на инактивацию аттенуированных и вирулентных штаммов полиовируса формалином (1:4000, 37°С) и, в то же время, способствует сохранению иммуногенности за счет стабилизации D-антигена.
Применяют следующие методы консервации вирусов:
при хранении вирусного материала (кусочки органов или тканей) часто используют глицерин (50%-ный раствор на ИХН), который обладает бактериостатическим действием и в то же время защищает вирусы. При этом можно хранить несколько месяцев при 4С.
чаще всего хранят вирусы в холодильниках, обеспечивающих температуру -20, -30, -70С. При этой температуре некоторые вирусы без добавки защитных веществ сравнительно быстро теряют инфекционность. Хорошее защитное действие при замораживании и хранении вирусов оказывает добавка: инактивированной сыворотки крови или обезжиренного молока или 0,5-1,5% желатина.
Быстрая заморозка до минус 196С жидким азотом. Вирусы, чувствительные к низким значениям рН, следует замораживать в жидкостях, не содержащих однозамещенных фосфатов.
Лиофилизация – высушивание в замороженном состояние в условиях вакуума – очень хороший способ консервирования. В лиофилизированном виде вирусы могут храниться несколько лет.