- •Ветеринарная вирусология, ее достижения и задачи.
- •Вирионы - наиболее известная форма существования вирусов.
- •Вирусы как инфекционные агенты. Принципиальные отличия вирусов от других инфекционных агентов.
- •Генетические признаки вирусов и их использование в характеристике штаммов. Мутации у вирусов и их механизмы.
- •Действие на вирионы вирусов различных температур, уфл, кислот, щелочей, спиртов, дезинфектантов, окислителей и восстановителей, жирорастворителей, антибиотиков.
- •Диагноз на основе анализа клинических симптомов, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных.
- •18. Инактивированные вакцины.
- •19. Живые вакцины.
- •Значение вирусов для решения общебиологических проблем.
- •Индикация вирусов в патологическом материале по обнаружению вирионов и вирусных телец-включений.
- •Индикация, выделение и идентификация вирусов.
- •Обнаружение ( индикация) вируса в материале;
- •Иммуноферментный анализ. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Использование в вирусологии лабораторных животных. Устройство вивариев, правила техники безопасности при работе с лабораторными животными.
- •Масса животных в разном возрасте
- •Температура тела, пульс и число дыханий у здоровых животных
- •Состав крови некоторых лабораторных животных (по в.Н.Никитину)
- •Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток. Получение клеточных культур.
- •Клеточный геном и реализация генетической информации в нормальной клетке.
- •Клеточный и гуморальный противовирусный иммунитет, их взаимодействие.
- •Принципы культивирования вирусов.
- •Методика титрования и расчёта титра вируса в оое и бое, в единицах 50%-го инфекционного действия.
- •Методы уничтожения, инактивации и консервации вирусов.
- •Механизм персистенции вирусов в клетках.
- •Неспецифические факторы противовирусной защиты организма.
- •Окончательный диагноз на основе обнаружения и идентификации вирусов в организме больных животных.
- •Обнаружение ( индикация) вируса в материале;
- •Особенности противовирусного иммунитета.
- •Открытие вирусов и история их изучения.
- •Патогенез вирусных болезней животных.
- •Персистенция вирусов. Роль факторов иммунитета на этапах патогенеза вирусной болезни.
- •Получение патологического материала, его транспортировка.
- •2.1 Получение и обработка патологического материала
- •2.2 Получение патологоанатомического материала
- •2.3 Получение проб для гистологического исследования.
- •2.4 Транспортировка и хранение проб.
- •Понятие о титре вируса. Единицы количества вируса: оое, бое, лд, ид, элд, эид, цпд, гае. Выражение в них титра вирусов.
- •Понятия о гене и геноме вирусов. Вирусная популяция, вирусный штамм, вирусный клон.
- •Правила работы с вируссодержащими материалами.
- •1.1 Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом
- •Получение и транспортировка патологического материала для вирусологических исследований.
- •Устройство вирусологической лаборатории.
- •Превращение вирусологии в одну из фундаментальных биологических наук.
- •Принципы диагностики вирусных болезней животных.
- •Природа вирусов, их место и роль в биосфере. Роль вирусов в эволюции жизни на Земле.
- •Вирусы играют эволюционную роль.
- •Пути проникновения вирусов в организм животного. Первичная локализация и циркуляция вируса.
- •Вторичная циркуляция вируса. Механизм повреждающего действия вирусов на клетки.
- •Полимеразная цепная реакция, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реконвалесценция, вирусоносительство и вирусовыделение.
- •Репродукция вирионов вирусов.
- •Реакция иммунной флуоресценции, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция нейтрализации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция непрямой гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Роль вирусов в инфекционной патологии животных, растений и человека.
- •Реакция связывания комплемента, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Реакция торможения гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
- •Использование в вирусологии реакции гемадсорбции.
- •Серологическая диагностика вирусных болезней по приросту титра антител в парных сыворотках крови.
- •Систематика вирусов. Принцип систематики, ее научная и практическая ценность.
- •Основные критерии таксономической классификации вирусов
- •Специфическая профилактика вирусных болезней животных.
- •Специфические факторы противовирусного иммунитета и их формирование.
- •Структура и химический состав вирионов вирусов.
- •Типы вирусных геномов. Структурные (вирионные) и неструктурные белки вирусов, их свойства и отличия от клеточных белков, их функции.
- •Вирусные геномы. Виды вирусных геномов.
- •Трансляция и образование структурных и неструктурных вирусных белков. Сборка вирионов и их выход из клеток.
- •Титрование вирусов.
- •Ферменты вирионов, липиды и углеводы в составе вирионов.
- •3.1. Белки вирусов
- •3.2. Липиды вирусов
- •3.3. Углеводы вирусов
- •Формы взаимодействия вирионов с клетками.
- •Формы и размеры вирионов. Типы симметрии вирионов и их обусловленность. Нуклеиновые кислоты вирусов, их функции и отличия от клеточных нуклеиновых кислот.
- •Экономический ущерб, наносимый животноводству вирусными болезнями животных.
- •Вирусы гриппа птиц и ньюкаслской болезни и их дифференциация в ртга.
- •Вирус африканской чумы однокопытных.
- •Вирус африканской чумы свиней.
- •Вирус болезни Ауески.
- •Вирус болезни Тешена.
- •Вирус инфекционного бронхита кур.
- •Вирус инфекционного бурсита кур.
- •Вирус контагиозного пустулезного дерматита овец и коз.
- •Вирус чумы крупного рогатого скота.
- •1. Определение болезни
- •3. Возбудитель болезни
- •4. Эпизоотология
- •5. Патогенез
- •6.Течение и клиническое проявление
- •7. Патологоанатомические признаки
- •8. Диагностика и дифференциальная диагностика
- •9. Иммунитет, специфическая профилактика
- •10. Профилактика
- •11. Лечение
- •12. Меры борьбы
- •Вирусы гриппа.
- •1. Грипп птиц.
- •2. Грипп свиней.
- •3. Грипп лошадей.
- •Вирусы энцефаломиелитов лошадей.
- •Вирус миксоматоза кроликов.
- •Вирус геморрагической болезни кроликов.
- •Прионы и прионные инфекции животных.
- •6.1. Общая характеристика прионов и прионных инфекций
- •6.1. Основные различия нормальной и патогенной форм прионного белка
- •6.2. Прионные инфекции животных
- •6.3. Скрепи
- •6.4. Энцефалопатия норок
- •Медленные вирусные инфекции.
- •Вирус Алеутской болезни норок.
- •Вирус чумы плотоядных.
- •Вирус инфекционной анемии лошадей.
- •Вирус парагриппа-3.
- •Аденовирусы крупного рогатого скота.
- •Вирусы лейкозов.
- •Вирус болезни Марека.
- •Вирусы респираторно-репродуктивного синдрома свиней и парвовирусной инфекции свиней.
- •Парвовирусная инфекция свиней
- •Вирус бешенства.
- •Лабораторная диагностика бешенства.
- •Лабораторная диагностика лейкоза крс.
- •5.6. Число лейкоцитов и лимфоцитов у здорового, подозрительного по заболеванию и больного лейкозом крупного рогатого скота («лейкозный ключ»)
- •Лабораторная диагностика оспы.
- •Лабораторная диагностика ящура.
Реакция иммунной флуоресценции, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
Метод иммунофлуоресценции называют еще РИФ, метод меченых антител.
Принцип РИФ основан на использовании явления флюоресценции, который состоит в испускании света атомами вещества, поглотившими избыточную внешнюю энергию и пришедшими в состояние возбуждения. При этом используют люминесцентную микроскопию (рис. 7)
Рисунок 7. Люминесцентный микроскоп МЛ-2
В диагностических исследованиях методом РИФ в качестве объекта исследования могут быть мазки – отпечатки, срезы органов и тканей, соскобы, гистологические срезы, препараты тканевых культур.
При прямом методе РИФ мазок - отпечаток обрабатывают сывороткой, меченной антителами, гомологичными тому вирусу, наличие которого предполагается. Если в мазке содержится антиген, гомологичный антителам сыворотки, то образуется комплекс антиген + антитело. Препараты отмывают, сушат и исследуют под люминесцентным микроскопом, который устроен так, что на препарат падает пучок сине-фиолетовых лучей, а в глаз наблюдателя попадают только желто-зеленые лучи, которые испускает комплекс антиген + антитело. По этому свечению и судят о наличии в материале антигенов, гомологичных антителам меченой сыворотки.
Непрямой метод состоит в том, что мазок - отпечаток обрабатывают дважды: вначале немеченой антивирусной сывороткой, а затем после отмывания - меченной антивидовой. После второго отмывания препарат высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом. Обнаружение в препарате специфической флюоресценции указывают на наличие в материале антигенов, гомологичных использованной противовирусной сыворотке.
По эффективности непрямой метод имеет преимущества перед прямым методом.
В целом метод флюоресцирующих антител обладает рядом достоинств перед другими методами.
Реакция нейтрализации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
Второе место среди защитных реакций занимает реакция нейтрализации, которая служит для определения и характеристики иммунного состояния и его роли как механизма по выведению паразита и нейтрализации продуктов его распада и жизнедеятельности. Как правило, реакцию нейтрализации проводят путем смешивания сыворотки животного с патогенным организмом, по отношению к которому данное животное считается иммунным. После инкубации смесь исследуютin vivo или in vitro на наличие активного патогена. В этом случае, как и в реакции защиты, все присутствующие в сыворотке иммуноглобулины могут участвовать в реакции и проявлять тем самым свою активность in toto. По сравнению с большинством других реакций на антитела эта реакция не связана с каким-либо физическим проявлением, поскольку иммуноглобулины, активно разрушающие патогенный организм, могут не давать подобного эффекта.
Реакция нейтрализации ничего не говорит об общем иммунном состоянии животного, так как в ней участвуют только гуморальные антитела, т. е., как и в большинстве других реакций, активность клеточной иммунной системы здесь не имеет значения. Однако реакция нейтрализации имеет преимущество перед реакцией защиты, заключающееся в том, что она не оказывает отрицательного действия на здоровье подопытного животного и может повторяться неоднократно. При проведении почти всех реакций нейтрализации для демонстрации явления нейтрализации необходима какая-нибудь живая система, будь то целостный организм или культура ткани. В некоторых случаях, таких, как реакция торможения гемагглютинации миксовирусов и вируса чумы крупного рогатого скота, реакция нейтрализации хотя и проводится с «живыми» эритроцитами, однако последние могут использоваться после хранения в условиях консервации.
Реакцию нейтрализации можно полностью провести на одном животном, если патогенный организм ввести с одной стороны, а исследуемую сыворотку с другой стороны тела животного. Однако чаще всего этот организм (или токсин) и содержащие антитела растворы оставляют на некоторое время для взаимодействия in vitro и затем в смеси исследуют активность патогенного организма. Самые первые иммунологические реакции, использованные Фон Берингом и Китазато, принадлежали к реакциям именно такого типа. Эти исследователи установили, что антисыворотка, добавленная к столбнячному токсину, нейтрализует токсическое действие последнего, если смесь вводится морской свинке. С тех пор реакция нейтрализации интенсивно используется в работе с антитоксинными антителами, особенно с антителами против токсина клостридий; ее можно применять также при дифференциации видов внутри рода. Так, например, реакцию нейтрализации in vitro используют для быстрой идентификации Clostridium welchii. Выделяемый этим организмом токсин образует мутное кольцо вокруг колонии, растущей на агаре с сывороткой или яичным белком. Этот феномен называется реакцией Наглера. Он может быть подавлен без уничтожения организма, если до введения микроорганизма над агаровой пластинкой распылить специфический антитоксин.
Токсины можно выделить и очистить и определить для них ЛД50 при помощи метода, описанного в главе 11. После этого путем титрования легко установить эффективность антисыворотки. Для этого растворы с серийным разведением сыворотки смешивают со стандартным количеством ЛД60 токсина и определяют токсическое действие каждой смеси путем инокуляции их группе подопытных животных, например мышей. Выживают те животные, которым введены низкие разведения антисыворотки и соответственно количество антител, достаточное для того, чтобы нейтрализовать токсин. За конечную точку титрования можно выбрать точку, соответствующую такому разведению сыворотки, когда она защищает от гибели только 50% мышей.</P><P> Аналогичным образом реакцию нейтрализации можно применить для титрования антител к бактериям, но особенно полезной она оказалась в работе с вирусами. Причина этого заключается в том, что в последнем случае используется качественная методика культуры ткани, которую можно поддерживать в строго стандартных условиях. Поэтому каждый образец культуры ткани может быть идентичным другим до такой степени, которой нельзя добиться с любыми неинбредными стерильными животными. Другое преимущество реакции нейтрализации заключается в том, что для ее проведения требуется значительно меньше вируса, чем для реакции агглютинации, преципитации или связывания комплемента.</P><P> <SPAN style="letter-spacing: 5px;">50%-ную тканевую цитопатогенную дозу вируса ТЦД50 можно определить точно так же, как это делается при измерении ЛД50 или ИД50. Используемый в этом случае метод основан на том факте, что если тканевую культуру инфицировать вирусом, который способен в ней развиваться, то о наличии большинства инфекций можно судить по появлению признаков цитопатогенного действия па клеточном монослое. В чашке Петри легко увидеть «бляшки» разрушенных клеток на участке взаимодействия отдельной вирусной частицы с монослоем клеточной культуры. Если подобный эффект отсутствует, то о наличии инфекции судят по другим признакам, например адсорбции эритроцитов на поверхности культуры клеток.
В ходе предварительной инкубации с каждым из серийных разведений антисыворотки должно взаимодействовать точно измеренное количество вирусной суспензии, чтобы определить то наименьшее разведение сыворотки, которое уменьшает или полностью устраняет цитопатогенный эффект в результате нейтрализации вируса. Этим способом можно точно определить активность противовирусных антител, т. е. данный метод становится, таким образом, важным средством для измерения нейтрализующей активности сыворотки. По этой причине особенно широко реакция нейтрализации применяется в вирусологии при идентификации вирусов. Однако, при всех своих достоинствах, этот метод требует много времени, исключительной лабораторной отработки и тщательного внимания к деталям.