материалом, окисляются за счет восстановления других атомов углерода того же вещества. Микроорганизмы, осуществляющие брожение, культивируются без доступа воздуха.

Микроорганизмы могут окислять по существу любые имею­щиеся в природе вещества. Наиболее универсальным энергетиче­ским материалом являются сахара, аминокислоты, органические кислоты, спирты. Есть микроорганизмы, которые могут окислять такие устойчивые соединения, как парафины, воск, нефть. Причем, среди гетеротрофов есть полифаги, использующие широкий круг веществ, и есть специализированные формы, приспособившиеся к окислению небольшого числа соединений.

Большинство гетеротрофов получают энергию и создают уг­леродную основу веществ клетки из одного и того же соединения. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и энергетических процессов нуждаются в разных углеродсодержащих соединениях. Например, гомоферментативные молочнокислые бак­терии получают энергию при сбраживании Сахаров, но почти не используют их для построения углеродных цепочек веществ клет­ки. Для конструктивных целей они требуют готовые аминокисло­ты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины.

Автотрофные микроорганизмы

Автотрофы — это микроорганизмы, которые способны исполь­зовать углекислоту в качестве единственного источника углерода и не нуждаются в готовых органических веществах.

Конструктивный обмен автотрофов. Автотрофные микроорганизмы обладают наиболее высокими синтетическими способностями. Для построения веществ клетки они могут исполь­зовать в качестве единственного источника углерода углекислоту. Азот и другие необходимые элементы автотрофы получают из ми­неральных солей. В среды для автотрофов не нужно включать ор­ганические вещества. Для них готовят минеральные среды. Чтобы обеспечить микроорганизмы углекислотой, ее продувают через среду или вводят в среду карбонаты или бикарбонаты. Иногда вполне достаточно контакта среды с воздухом, откуда микроорга­низмы черпают С0₂.

Энергетический обмен автотрофов. Автотрофные микроорганизмы различаются по способу получения энергии. Не­которые автотрофы (пурпурные и зеленые серобактерии) имеют пигментную систему — хлорофиллы особого типа, и могут исполь­зовать энергию света. Они осуществляют, как и зеленые растения, фотосинтез. Их культивируют при дневном или искусственном (в люминостатах) освещении. Другие автотрофные микроорганиз-

мы используют энергию окисления минеральных веществ: соедине­ний серы (бесцветные серобактерии), азота (нитрификаторы), железа (железобактерии). Эти микроорганизмы осуществляют хемосинтез и называются хемолитоавтотрофами.

63

КОНЦЕНТРАЦИЯ ВЕЩЕСТВ В ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных границах концентрации веществ в среде. В очень разбавленных и в сильно концентрированных средах размножение большинства микроорганизмов замедляется и может даже прекратиться. Поэто­му вещества необходимо вносить в среды в количествах, достаточ­ных для обеспечения хорошего роста. Для разных микроорганиз­мов эти количества весьма различны. Однако имеются некоторые общие принципы, которыми следует руководствоваться при состав­лении питательных сред. Считается, что для нормального развития микроорганизмов необходимые элементы следует вводить в среды в соотношении, примерно соответствующем соотношению их в клетке. Установлено, что для построения веществ клетки микро­организмов наиболее благоприятным соотношением между углеро­дом и азотом в среде является соотношение 20: 1. Но при этом следует учитывать, что вещества, служащие для получения энер­гии (а ими часто являются углеродсодержащие соединения), добав­ляются в большем количестве, чем вещества, идущие на конструк­тивный обмен. Если на энергетические и конструктивные процессы используется одно и то же вещество, оно должно быть внесено в среду в таком количестве, чтобы его хватило на все нужды микро­организмов.

Ориентировочные концентрации факторов роста, влияющие на развитие микроорганизмов, и некоторые особенности факторов роста приведены в табл. 1.

Примерные концентрации минеральных солей, необходимые для роста различных микроорганизмов, приведены в табл. 2.

Солевой состав сред можно видоизменять с таким расчетом, чтобы суммарная концентрация каждого катиона или аниона со­ответствовала указанным в таблице количествам.

Особый случай представляет осмофилия. Это способность не­которых микроорганизмов жить только в условиях высоких кон­центраций веществ. Такие микроорганизмы не могут развиваться при низком осмотическом давлении. Для них составляют среды, более концентрированные, чем для других микроорганизмов.

При длительном культивировании может происходить значи­тельное концентрирование жидких сред вследствие испарения со­держащейся в них воды, что окажется неблагоприятным для роста микроорганизмов. Поэтому при продолжительной инкубации мик­роорганизмов необходимо регулярно доводить культуральную жидкость стерильной водой до первоначального объема.

Количество и соотношение компонентов среды, обеспечиваю­щие нормальное развитие микроорганизмов, не всегда подходят для решения других исследовательских и практических задач. Это справедливо, например, в случае оптимизации того или иного био­логического процесса — накопления биомассы или какого-либо продукта жизнедеятельности (фермента, витамина, антибиотика и т. д.), так как далеко не всегда увеличение биомассы идет парал­лельно биосинтезу интересующего нас вещества. Нередко при обильном росте микроорганизмов желаемый продукт жизнедея­тельности почти не образуется. В этих случаях требуется подби­рать концентрации и соотношение компонентов среды с таким рас­четом, чтобы они обеспечили оптимальное течение интересующего нас процесса. С этой целью можно применять методы математи-

3 Зак. 322 65

ческого планирования эксперимента (В. Н. Максимов и В. Д. Фе­доров, 1969).

Большинство веществ, которые вводят в питательные среды для микроорганизмов, растворимо в воде. Однако микроорганиз­мы могут использовать и не растворяющиеся в воде соединения. Для распределения таких веществ в средах существует ряд прие­мов. Например, целлюлозу добавляют в среды в виде полосок или кусочков фильтровальной бумаги. Нефть, масла, жидкие уг­леводороды, жиры, а также измельченные твердые парафины при­водят в соприкосновение с жидкой средой, налитой тонким слоем. В этом случае вещества концентрируются на поверхности жидко­сти. Площадь соприкосновения таких веществ со средой увеличи­вают встряхиванием сосудов на качалке, энергичным продуванием воздуха через среду, а также эмульгированием в смесителях или гомогенизаторах. Иногда прибегают к адсорбции маслоподобных соединений на минеральных веществах: глине, песке, диатомовой земле, асбесте, тальке, стеклянной вате, пемзе и др.

Газы (углекислоту, метан и др.) либо продувают через среду, либо помещают сосуды для культивирования в эксикатор, запол­ненный нужным газом или определенной газовой смесью.

СПОСОБЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И РЕЦЕПТЫ НЕКОТОРЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Различия в потребностях микроорганизмов нашли отражение в большом количестве сред, предложенных для их культивирова­ния. Характеристика всех сред не является задачей руководства. Поэтому ниже изложены способы приготовления только некото­рых, наиболее употребительных натуральных сред, пригодных для культивирования многих микроорганизмов. Набор полусинтетиче­ских и синтетических сред подобран с целью проиллюстрировать специфические потребности различных микроорганизмов.

Натуральные среды для культивирования гетеротрофных микроорганизмов

Для культивирования различных гетеротрофных микроорга­низмов довольно часто используют три типа сред неопределенно­го состава, которые удовлетворяют потребностям многих микроор­ганизмов: мясо-пептонные среды, пивное сусло и среды с автоли-затом дрожжей.

Мясо - пептонный бульон (МПБ). Основой для его приготовления является мясная вода, которую обычно готовят сле­дующим образом. 500 г мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий, разрезают на мелкие кусочки (или пропускают через мясорубку), заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 часов или в термостате при 30° С на

6 часов, а при 37° С — на 2 часа. За это время из мяса экстрагиру­ются различные вещества, в том числе, водорастворимые витами­ны. Затям мясо отжимают через марлю или полотно и фильтрат кипятят 5 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначаль­ного объема. К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. Получают мясо-пептонный бульон — МПБ.

Пептоны представляют собой смесь полипептидов (продукты неполного разложения белка) с большим или меньшим содержа­нием свободных аминокислот ферментов,нуклеиновых кислот и некоторых витаминов. Их получают кислотным или ферментатив­ным гидролизом мяса или казеина. Так, наиболее часто применяе­мый в лабораторной практике пептон семипалатинского завода получают ферментативным гидролизом. Пептоны различаются между собой степенью протеолиза. Например, протеозный пептон Дифко готовят путем кратковременного воздействия пепсином; он содержит много высокомолекулярных пептидов. Пептон, который получают при более глубоком протеолизе, состоит из более корот­ких пептидов. Под названием «триптон Дифко» известен продукт дальнейшего расщепления белков с помощью трипсина, который содержит низкомолекулярные пептиды и свободные аминокислоты.

Некоторое представление о содержании азотистых веществ в МПБ дает определение в нем количества аминного азота (А. Н. Белозерский и Н. И. Проскуряков, 1951).

Таким образом, МПБ — богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их вносят в МПБ чаще всего в количестве 1—2%. МПБ стерилизуют при 1 атм.

Н е о х м е л е н н о е пивное сусло. Является очень хорошей средой для ряда молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрож­жей, плесневых грибов и других микроорганизмов. Для приготов­ления сусла ячмень проращивают. При этом в нем активизируются протеолитические и амилолитические ферменты. В лабораторных условиях иногда пользуются не пророщенным, сухим ячменем. Его размалывают, заливают водой и выдерживают при 55—58°С, все время перемешивая. При этом амилолитические ферменты более или менее полно гидролизуют крахмал до мальтозы (осахаривание крахмала контролируют йодной пробой), а протеолитические фер­менты гидролизуют белки до аминокислот и полппептндов. Полу­чается раствор, чрезвычайно богатый питательными веществами, в котором есть все необходимое для очень требовательных микро­организмов: аминокислоты, элементы нуклеиновых кислот, вита­мины (в основном, группы В), органические кислоты, минеральные соли и в отличие от мясо-пептонных сред большое количество уг­леводов (около 80% мальтозы, глюкоза, декстрины и др.). Полу­ченную мутную жидкость фильтруют через бумажную пульпу (мязгу) и определяют содержание сахара в фильтрате. Для этого обычно пользуются ареометром Баллинга, градусы (°Б) которого

3* 67

примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сус­ле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для грибов чаще всего используют 3—4°Б сусло, для дрожжей —6— 8°Б, а для наиболее требовательных молочнокислых бактерий — 8—12°Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 атм. После стерилизации в сусле может выпасть белковый осадок. Если необходимо, его отфильтровывают через вату, и сусло вновь стерилизуют. Однако многократное автоклавирование сусла нежелательно, так как тер­мическая обработка приводит к разрушению в нем ряда компонен­тов, в первую очередь витаминов и углеводов. Солодовое сусло имеет обычно слегка кислую реакцию.

Среды из дрожжей. Дрожжевая клетка содержит полно­ценные белки и все водорастворимые витамины. Поэтому отвары дрожжей очень часто применяются как источник аминокислот и витаминов. Как источник витаминов особенно ценен дрожжевой автолизат. Для приготовления дрожжевого автолизата к 2 кг прессованных дрожжей прибавляют 2 л водопроводной воды, про­кипяченной и остуженной до 60°С, смешивают в гомогенную массу и ставят в термостат при 50 С на 72 часа. При этом дрожжи отми­ра ют, а ферменты клеток гидролизуют сложные вещества, и дрож­жевая масса разжижается. После этого массу нагревают в авто­клаве при 105С 30 мин. Затем фильтруют до полной прозрачно­сти. Прозрачный фильтрат содержит около 0,9% азота. Осадок разводят в 1200 мл воды и вновь фильтруют. Фильтраты объеди­няют. Содержание общего азота в смеси становится равным 0,6— 0,8%. Жидкость нейтрализуют до рН 6,8—7,0, разливают неболь­шими порциями в пробирки или колбы и стерилизуют 15 мин при 0,5 атм. Готовый к употреблению автолизат лучше хранить в холо­дильнике. Автолизат дрожжей особенно богат парааминобензой-ной кислотой, пантотеновой кислотой и пиридоксином. В количе­стве 20—30 мл на литр среды он удовлетворяет потребности наи­более прихотливых микроорганизмов. Многие же микроорганиз­мы довольствуются 0,5—1 мл автолизата на литр среды и даже меньше. Когда дрожжевой автолизат вносится в среду в большом количестве, он может быть не только источником витаминов, но и аминокислот. Автолизат дрожжей как источник витаминов удоб­но добавлять в небольшом количестве к синтетическим средам.

Среды для ряда микроорганизмов (клубеньковых бактерий, дрожжей) часто готовят на дрожжевой воде. Для приготовления дрожжевой воды 70—100 г свежих прессованных или 7—10 г су­хих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л дистиллированной воды, дают отстояться в высоком цилиндре на холоду, жидкость декантируют и фильтруют. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. В дрожжевую воду вносят необходи­мые вещества (углеводы, соли), доводят рН среды до нужного значения и стерилизуют при 0,5 атм или дробно — в кипятильни­ке Коха по 20мин, 2—3 дня. Иногда дрожжевую воду использу­ют как самостоятельную среду, без добавок.

68

Широко применяется в лабораторной практике также гидро-лизат казеина, содержащий пептиды, все важнейшие аминокисло­ты и факторы роста. Гидролизат казеина используют главным об­разом как источник аминокислот. Кроме указанных наиболее рас­пространенных сложных сред, для культивирования ряда гетеро­трофных микроорганизмов используют различные овощные отвары, среды на почвенной вытяжке, молочные среды и др.

Полусинтетические и синтетические среды для культивирования некоторых гетеротрофных микроорганизмов

Для культивирования многих представителей родов Pseudo-monas, Bacterium, Mycobacterium и др., которых обычно поддер­живают на мясо-пептонных средах, можно использовать следую­щие синтетические среды.

В среде № 2 натриевая соль органической кислоты может быть заменена аммонийной. В этом случае другой источник азо­та не вносят. Дрожжевой автолизат можно заменить необходимым набором витаминов.

В ряде случаев хорошие результаты получаются при культи­вировании микроорганизмов на средах, содержащих в качестве источников углерода не одну, а две органические кислоты, напри­мер пируват и фумарат, пируват и сукцинат, ацетат и лактат.

Для Lactobacterium delbruckii, отличающихся особой требо­вательностью к субстрату и поэтому обычно выращиваемых на 8 -

Уплотнение сред. В настоящее время для уплотнения большин­ства сред используют агар-агар — сложный полисахарид, полу­чаемый из некоторых морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может использовать его в качестве субстрата, и поэтому он является лишь уплотняющим средством. Агар-агар образует в воде гели, плавящиеся примерно при 100° С и затвердевающие при температуре около 40° С. Поэто­му на агаризоваиных средах можно культивировать микроорганиз­мы при относительно высокой температуре. Агар-агар выпускают в виде пластин, «стебельков» или порошка. Чаще всего агар-агар добавляют к средам в количестве 2% (например, к мясо-пептонно-му бульону, получая мясо-пептонный агар МПА). Среду с внесен­ным в нее агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Если предполагается культивировать бакте­рии на скошенной агариз-ованной среде в пробирках, то каждая пробирка заполняется средой не более чем на 7з. Скашивание сред осуществляют после стерилизации, желательно незадолго пе-

ред посевом (чтобы среды не подсохли). Для этого, предваритель­но расплавив среду на водяной бане, пробирки устанавливают в наклонном положении (рис. 36) и дают среде застыть. Среда не должна доходить до ватной пробки на 2—3 см.

Среду, предназначенную для культивирования бактерий на чашках, разливают по 20—25 мл в каждую пробирку. Для этого

обычно попользуют прооирки большего объема, чем для ско­шенного агара, учитывая, что количество среды при стерили­зации не должно превышать 1\2 высоты пробирки. При раз­ливе горячих агаровых сред в пробирки стараются не смочить средой верхний край во избе­жание приклеивания ватной пробки к стеклу. Для разлива в чашки Петри среду можно стерилизовать и в колбах. В этом случае предварительное

(до стерилизации) плавление агара не производят.

При остывании агар выделяет «конденсационную» воду. Чем меньше концентрация агара, тем больше выделяется воды. Если хотят получить более влажную среду, вносят 1,5%, а более плот­ную и сухую — 3% агара. Когда требуется вырастить микроор­ганизмы на агаризованной среде в чашках Петри в виде изоли­рованных колоний, чашки после засева помещают в термостат дном вверх. Если поставить чашки, не перевертывая их, то скап­ливающийся на внутренней стороне конденсат стекает на поверх ность среды и мешает получению изолированных колоний микро организмов.

Агар-агар имеет слегка щелочную реакцию, поэтому его до­бавление иногда немного повышает значение рН среды. В кислой среде (рН ниже 5.0) при продолжительном нагревании, напри­мер, при стерилизации агар частично гидролизуется и теряет способность образовывать гель, т. е. не застывает. В случае создания агаризованных сред для кислотолюбивых микроорганизмов можно рекомендовать раздельную стерилизацию агара (в воде) и жидкой среды или доведение рН среды до нужного значения после стерилизации стерильными растворами кислоты или щелочи.

Агар-агар всегда содержит примеси органических и мине­ральных веществ. Поэтому агар, предназначенный для введения в среды строго определенного состава, предварительно очищают («выщелачивают»). Для этого агар помещают в эмалированную или стеклянную посуду, заливают водопроводной водой и ставят в термостат на 30—37°С. Примеси выщелачиваются в воду и разлагаются под действием развивающихся в ней микроорганизмов. Через день-два жидкость сливают, агар промывают несколько раз

свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят в термостат. Когда и эта вода помутнеет, ее опять заменяют новой, и так де­лают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Обычно через 2—3 недели получают очень чистый агар, почти совершенно лишенный растворимых органических веществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый мешок и 2— 3 суток промывают проточной водопроводной водой. Затем aгap раскладывают тонким слоем и просушивают на воздухе или в су­шильном шкафу.

Для уплотнения некоторых сред иногда используют желатину.

Этобелок,приготовленный из кожи и костей. Образуемый желати­ной гель плавится при температуре около 25°С, которая ниже обычной температуры инкубации большинства микроорганизмов (30—37°С). Кроме того, желатина разжижается протеолитическп-мп ферментами, имеющимися у ряда микроорганизмов. Эти свой­ства желатины сильно ограничивают ее применение в качестве уп­лотняющего средства. В настоящее время желатину используют главным образом для диагностических целей: для выявления про-теолитической активности микроорганизмов, для получения «ги­гантских» и глубинных колоний дрожжей. В первом случае упот­ребляют мясо-пептонную, во втором — сусловую желатину. К мя-со-пептонному бульону или суслу добавляют 10—15% желатины, оставляют ее набухать 5—10 мин и нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до необходимого значения. Же­латина имеет кислую реакцию и обладает большой буферностыо, поэтому на ее нейтрализацию идет больше щелочи, чем, например, на нейтрализацию МПА. Готовую желатиновую среду разливают в сосуды для культивирования и стерилизуют при 0,3—0,5 атм 15 мин или дробно — 3 раза по 20 мин в кипятильнике Коха. Продолжительное нагревание выше 100°С вызывает частичную пептонизацию желатины и понижает точку ее застывания.

Для уплотнения минеральных сред или сред строго определен­ного состава удобно использовать кремнекислый гель — уплотняю­щее средство Неорганической природы. Кремнекислый гель введен в микробиологическую практику С. Н. Виноградским. Гель готовят следующим образом. К соляной кислоте уд. веса 1,1 добавляют при перемешивании равный объем жидкого стекла (раствор

Na₂Si0₃ или K2SiO3) того же уд. веса (1,1). Смесь разливают в чашки Петри, по 20—30 мл в каждую. Чашки оставляют в покое на горизонтальной поверхности на несколько часов до образования кремнекислого геля вследствие реакции

Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стеклянный или эмалированный сосуд и промывают 2—3 суток проточной водой для удаления хлоридов. Затем гель промывают несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе промывных вод с 1%-ным

раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов обра­зуется белый осадок. Отмытые от хлора пластинки пропитывают 2—3 мл среды, концентрация всех составных частей которой должна быть в 5—7 раз выше, чем в соответствующей жидкой сре­де. Затем пластинки осторожно подсушивают в сушильном шкафу при 50—60°С, следя за тем, чтобы гель не дал трещины. Если не­обходимо, чашки завертывают в плотную пергаментную бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при(0,5 атм 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать. Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Кремнекислые пластин­ки, заготовленные впрок, хранят в сосудах с водопроводной водой.

Некоторые специфические особенности агар-агара, желатины и кремнекислого геля представлены в табл. 3.

Осветление сред. Для диагностических исследований и получе­ния изолированных колоний анаэробов часто необходимо иметь прозрачные среды. В ряде случаев прозрачную среду можно полу­чить, отфильтровав ее от осадка через ватный фильтр. Но иногда этого бывает недостаточно и тогда прибегают к специальной об­работке среды.

Осветление сред часто осуществляют с помощью белков ку­риных яиц. Белок тщательно отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования сплошной пены. Взбитый белок выливают в среду, из расчета белок одного яйца на 50 мл среды. Плотная среда должна быть предварительно расплавлена, температура среды должна быть 40—50°С, реакция среды (рН) — слабощелочная. Среду с белком тщательно перемешивают и про­гревают при 100°С в автоклаве или в кипятильнике Коха в тече-