3.1.2. Выявление косвенных показателей

3.1.2.1. Определение общих колиформных бактерий (бгкп)

Показатель БГКП идентичен показателю «общие колиформные бактерии» (ОКБ).

ОКБ — грамотрицательные, неспоровые, оксидаза-отрицательные палочки, способные развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста. Ферментируют лактозу при

35-37 ^оС за 24-48 час с образованием кислоты, газа и альдегида, т.е. на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24-48 час.

В зависимости от загрязнённости почвы БГКП можно определять титрационным методом для почв с невысокой степенью фекального загрязнения), либо методом мембранных фильтров (для слабозагрязненных почв ), либо методом прямого посева на среду Эндо (для почв с высокой степенью загрязнения).

Чаще используют титрационный метод.

Титрационный метод

Из разведения 1:10 почвенной суспензии 10 см³ засевают на 90 см³ среды Кесслера, остальные разведения сеют по 1 см³ в 9 см³ среды. Посевы выращивают при температуре 37 ^оС 48 часов. При отсутствии роста (помутнение, газообразование) дают отрицательный ответ. При наличии помутнения и газообразования или при наличии только помутнения делают высев на среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при 37 ^оС 18-24 час. Отбирают розовые, красные или малиновые с металлическим блеском колонии, изучают морфологические, тинкториальные свойства, ставят оксидазный тест. По 2-3 колонии каждого типа (грамотрицательные, оксидазаотрицательные) засевают параллельно в 2 в пробирки с полужидкой или жидкой с поплавком средой с лактозой, инкубируют в термостате 37 ^оС 18-24 час. При ферментации лактозы с образованием кислоты и газа дают положительный ответ на БГКП.

Результаты выражают в величинах коли-индекса.

Норматив. Индекс БГКП 1-10 клеток/г почвы

Метод мембраной фильтрации. Используют в качестве ускоренного метода. Применяют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм. Фильтруют 5,0-10,0 см³ почвенной суспензии первого разведения (1:10) через мембранные фильтры, сеют на дифференциальную питательную среду с лактозой, отбирают подозрительные колонии, идентифицируют бактерии по культуральным и биохимическим свойствам.

Метод прямых поверхностных посевов. Применяют при анализе загрязненных и сильно загрязненных почв.

На среду Эндо засевают по 0,1 или 0,2 см³ разведений почвы: от 10^-1 до 10^-3 для сравнительно чистых почв, из разведений до 10^-5 и 10^-6 для сильно загрязненных почв. Среды обычно используют подсушенные. Растирают посев шпателем. Инкубация посевов 37 ^оС 24 часа. Дальнейшая идентификация аналогична рассмотренной выше ( в титрационном методе, начиная со среды Эндо). Посчитывают количество колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашках, умножается на степень десятикратного разведения. Результаты выражают в количестве КОЕ/г.

Норматив. До 10 КОЕ/г

3.1.2.2. Определение энтерококков.

Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые с заостренными концами. В мазках располагаются парами или короткими цепочками, реже одиночно. При росте на жидких средах (лактозо-пептонная среда, ЛПС; щелочная элективная среда с полимиксином, ЩЭС) вызывают диффузное помутнение и образование осадка.

Для выявления энтерококков используют титрационный метод и метод мембранной фильтрации.

Титрационный метод применяют для анализа почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения.

Из разведений почвенной суспензии стерильной пипеткой берут 10 см³ и засевают во флаконы с 50 см³ жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют 24 час при 37 ^оС. При наличии признаков роста производят высев на плотные среды МИС (молочно-ингибиторная среда) или ЖСТ (желточная среда Турчинского). Инкубируют 24-48 часов. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.

При наличии аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест.

После выявления энтерококков устанавливают титр, при котором принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживают энтерококки. Для перевода титра в индекс, необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр.

Метод мембранной фильтрации.

Объем испытуемой пробы должен быть таким, чтобы не менее чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50.

Фильтруют 2-3 десятикратных объема испытуемой пробы. Фильтры помещают на азидную среду или ЖСТ и инкубируют 24-48 час при 37 ^оС.

Учет результатов на азидной среде.

На азидной среде выбирают фильтры, на которых выросло от 5 до 50 колоний. Посчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые, с ровными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным не четко оформленным центром. При необходимости 2-3 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по методу Грама.

Положительный ответ дают при обнаружении в мазках грамположительных полиморфных диплококков.

Учет результатов на среде ЖСТ.

Выбирают фильтры, на которых выросло не более 20-30 колоний. Посчитывают характерные для энтерококков колонии.

При обнаружении колоний другого вида – выпуклых белых мелких или ярко окрашенных, проводят микроскопию мазков, окрашенных по Граму и каталазный тест.

Положительный ответ выдают при наличии грамположительных полиморфных каталазоотрицательных диплококков.

Результаты выражают в индексах, для чего подсчитанное число колоний энтерококков суммируют и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

Для расчета индекса количество колоний энтерококков суммируют, умножают на 1000 и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

Норматив. Индекс энтерококков 1-10 КОЕ /г

Оценка степени эпидемической опасности почвы

Категория загрязнения почвы	Индекс БГКП	Индекс энтерококков	Патогенные бактерии, в том числе сальмонеллы
Чистая	1-10	1-10	0
Умеренно опасная	10-100	10-100	0
Опасная	100-1000	100-1000	0
Чрезвычайно опасная	1000 и выше	1000 и выше	0