Радиобиология с основами радиоэкологии

Тип репарации, идущий по приведенной схеме выщепле­ ние–замещение, получил название эксзиционной репарации.

Этот тип репарации еще называют темновой репарацией ДНК в отличие от близкого по механизму типа восстановления от повреждений, вызываемых ультрафиолетовой радиацией, который осуществляется под влиянием видимого света и называется фотореактивацией.

Основными критериями и доказательствами прохождения эксцизионной репарации являются выщепление поврежденных фрагментов ДНК, наличие упомянутых ферментов эндонуклеаз, которые образуются только при данном типе репарационного восстановления, и регистрация дополнительного «внепланового» синтеза ДНК. Регистрация их с помощью специальных методов показала идентичность указанного типа репарации для вирусов, бактерий, клеток высших растений, животных.

В кинетике репарации однонитевых разрывов ДНК выделяют два типа, различающиеся по скорости: быструю и медленную репарацию. При быстрой репарации для ликвидации половины разрывов в клетках млекопитающих, облученных γ-радиацией, необходимо несколько часов, медленной – 2–3 сут. Для клеток кишечной палочки Escherichia coli эти периоды значительно меньшие, соответственно 1–2 и 40–60 мин. Для клеток этой бактерии выделяют еще сверхбыструю репарацию, которая длится меньше минуты.

Путем эксцизионной репарации могут ликвидироваться и другие менее значимые повреждения ДНК, в частности, модификации нуклеотидных оснований, пиримидиновые димеры, депуринизации. Именно поэтому она считается основным механизмом восстановления ДНК.

Расшифровка механизма эксцизионной репарации ДНК, продемонстрировав возможность устранения в некоторых ситуациях фатальных по своей значимости повреждений мишени ионизирующей радиацией, явилась убедительным доказательством восстановления потенциально летальных повреждений клетки.

Репарация двойных разрывов молекулы ДНК. Если в результате облучения в одном месте молекулы ДНК возникает разрыв обеих спиралей, то восстановление по пути эксцизионной репарации оказывается невозможным ввиду отсутствия неповрежденной матрицы – гомологичного участка молекулы. Двойные разрывы являются наиболее тяжелым видом повреждения ДНК и именно они, приводя к ее деполимеризации, служат причиной пролиферативной гибели клеток.

Долгое время считалось, что двойные разрывы являются нерепарируемыми, т.е. этот тип повреждения имеет необратимый характер. Однако были получены самые различные экспериментальные доказательства возможности восстановления и

двойных разрывов молекулы ДНК. Пожалуй, наиболее весомым является установление феномена восстановления ее молекулярной массы с помощью метода центрифугирования в градиенте щелочной сахарозы. Суть его состоит в том, что при центрифугировании препаратов ДНК в этих условиях количественное состояние ее отдельных фракций по молекулярной массе описывается соответствующей седиментограммой с характерным пиком в максимуме молекулярной массы (рис. 15.4, а). При возникновении в ДНК при облучении ионизирующей радиацией двойных разрывов происходит ее деполимеризация и уменьшение молекулярной массы. На седиментограмме это отражается смещением пика в сторону более легких фракций ДНК (рис. 15.4, б). И в опытах с препаратами ДНК, выделенными из самых различных видов организмов, совершенно однозначно было показано, что с увеличением времени между облучением и выделением ДНК (как правило, в пределах нескольких часов) профиль ее седиментации все в большей степени приближается к первоначальному, т.е. нормальному состоянию (рис. 15.4, в, г).

Имеются, по крайней мере, две гипотезы, поясняющие механизм восстановления двойных разрывов молекулы ДНК – гомологической и негомологической репарации. Первая предполагает использование в качестве матрицы для репаративного синтеза поврежденного фрагмента ДНК неповрежденной молекулы гетеродуплекса. Этот процесс требует определенных рекомбинационных перестроек внутри сестринских хроматид (типичный пример репарации по типу обхода повреждения). Такая репарация приводит к полному восстановлению правильности генетического кода.

Вторая – негомологическая репарация состоит в соединении концов молекулы ДНК по месту разрыва. Оно может усложняться в связи с удалением концов молекулы на расстояния, при которых затрудняются или оказываются невозможными их лигазные сшивки. Тем не менее при определен-

Рис. 15.4. Характерные профили седиментации препаратов ДНК при центрифугировании в градиенте щ елочной сахарозы: а–г – пояснение в тексте.

ных конформационных условиях такое восстановление может осуществляться.

При негомологической репарации двойных разрывов, как и при гомологической, восстанавливается способность клеток к нормальному делению, потому что они позволяют избежать возникновение аберраций хромосом. Однако при негомологической репарации могут возникать определенные нарушения в генетическом коде. Исследованиями с культурой клеток животных установлено, что до 30% соединений разорванных концов молекул ДНК оказывается ошибочным или неточным.

Репарация сшивок ДНК–белок. В результате действия ионизирующей радиации кроме одиночных и двойных разрывов возникают межмолекулярные комплексы между молекулами ДНК и ядерными белками гистонами и другими белками, так называемые сшивки ДНК–белок. Количество их сравнительно невелико – всего несколько процентов по отношению к числу одиночных разрывов, но они могут приводить к специфическим нарушениям нормальных функций обоих компонентов и в первую очередь – ДНК.

Ранее считалось, что такие сшивки, как и двойные разрывы, нерепарабельны. Однако были получены экспериментальные доказательства, что со временем после облучения количество сшивок уменьшается – у различных объектов в два раза

втечение 0.5–2.0 ч, т.е. и они могут восстанавливаться по пути репарации. Механизм такой репарации до конца не изучен, но показано, что она ослабляется при недостатке кислорода и дефиците сульфгидрильных соединений. По-видимому, для ее осуществления – разрыва сшивок, или точнее, их разъединения без нанесения новых повреждений, необходимы дополнительная энергия и ферменты, содержащие SН-группы.

Индуцибельная, или SOS-репарация ДНК. Одним из типов пострепликативной репарации является SОS-репарация. Ее индуктором является появление при действии ионизирующей радиации специфических повреждений молекул ДНК, для восстановления которых в клетке синтезируются новые ферменты, отличающиеся от имеющихся конститутивных. Например, индуцибельная ДНК-полимераза, которая в отличие от конститутивной может проявить сродство к матрице и с некодирующими основаниями. Благодаря этой способности при SОSрепарации пострепликативных пробелов оказывается возможным синтез ДНК на матрице с повреждениями. Ни одна из конститутивных ДНК-полимераз не может вести синтез на такой матрице. В связи с тем, что эти ферменты синтезируются

вответ на повреждение, их называют индуцибельными, а репарацию – индуцибельной. Она, кроме того, получила название SОS-репарации, так как возникает в ответ на своеобразный сигнал беды – повреждение.

SОS-репарация – это определенная часть общей системы репарации ДНК и клетки в целом. Фундаментальной ее особенностью, отличающей от других типов репарации, является, повидимому, уникальная способность в ответ на повреждение активировать специфические гены (у различных организмов от нескольких генов до нескольких десятков), запускающие дополнительную систему восстановления.

Поскольку при SОS-репарации благодаря синтезу особой индуцибельной ДНК-полимеразы может осуществляться синтез ДНК на поврежденной родительской нити, оказывается неизбежным встраивание в нее оснований с ошибками. Это может приводить к увеличению частоты возникновения мутаций, вероятность появления которых при других типах репарации, напротив, снижается.

Безусловно, молекулярная репарация ДНК имеет важное общебиологическое значение. С ней связывают ликвидацию не только радиационных повреждений, но и спонтанно возникающих и индуцируемых различными физическими и химическими факторами мутаций, механизмы защиты человека от канцерогенеза, некоторых редких наследственных заболеваний, таких как прогерия, анемия Фанкони, синдром Блюма, атак- сия-телеангиэктазия, некоторых форм пигментной ксеродермы. Именно поэтому механизмы репарации ДНК изучены наиболее полно и глубоко.

Репарация других структур клетки. К понятию «поклеточного восстановления» имеет отношение не только репарационное восстановление ДНК, но и некоторых других структур клетки. Хотя следует признать, что молекулярные механизмы репарации этих других структур – макромолекул, молекулярных комплексов, различных внутриклеточных образований изучены­ значительно меньше.

О возможной репарация РНК и белков. По-видимому, особых механизмов репарации РНК и белков нет. Если под влиянием ионизирующей радиации в молекулах РНК и белков формируются одиночные и двойные разрывы, сшивки и другие типы повреждений, можно допустить, что за счет дополнительных транскрипций, индукторами или активаторами которых они и являются, может легко синтезироваться необходимое для клетки количество неповрежденных молекул.

Репарация хроматина. Многие ультраструктурные компоненты клетки представляют собой сложные объединения нуклеиновых кислот, белков и молекул других веществ. Одним из них является хроматин – надмолекулярный комплекс молекул ДНК (30–40%), гистонов (30–50%) и негистоновых белков, в том числе ферментов (5–30%). Структурно хроматин представляет собой нуклеопротеидные нити, из которых состоят хромосомы. На электронных микрофотографиях они напоминают

бусы, «снизанные» из нуклеосом, – суперспирализированных петлеобразных клубков из участков нуклеопротеидных нитей.

Составление хроматина из молекул перечисленных веществ базируется на межмолекулярном узнавании, физической основой которого являются пространственное и координационное соответствие структур взаимодействующих молекул, их сцепление и удержание с помощью межмолекулярных сил притяжения. Предполагается, что это силы Ван-дер-Ваальса электрической природы. Возникающий в результате их спонтанный или индуцируемый процесс получил название самосборки.

Под влиянием ионизирующей радиации в хроматине могут происходить как повреждения молекул отдельных его компонентов, так и нарушения межмолекулярных связей, вследствие чего он может распадаться на фрагменты. Восстановление, или самосборка de novo, может крайне затрудняться вследствие того, что отдельные повреждения ДНК и белков, в особенности гистонов, вызывают потерю способности к узнаванию порой на весьма протяженных участках молекул. В результате этого может происходить сильное нарушение функций хроматина, одним из проявлений которого является сравнительно легко регистрируемое возрастание объема транскрипции.

Однако доказано на самых разных объектах – эукариотах, что сравнительно быстро, практически в течение нескольких часов, происходит восстановление не только отдельных компонентов хроматина, в частности, репарация ДНК, но и его надмолекулярной структуры, а также функциональной способности. В восстановлении крайне важную роль играет уникальное явление, получившее название молекулярной селекции, суть которой состоит в отборе молекул, в данной ситуации белков, не несущих повреждений в своей структуре. Более того, отбор сопровождается синтезом новых молекул белков, а также удалением поврежденных, как бы выпадающих из сборки хроматина вследствие потери способности к молекулярному узнаванию. Эти процессы требуют усиления биосинтеза ядерных белков и повышения активности протеолитических ферментов, гидролизирующих молекулы поврежденных белков.

Молекулярная селекция, или отбор, а также процессы самосборки поврежденных излучением компонентов хроматина играют важную роль в репарации не только делящихся, но и некоторых типов дифференцированных и специализированных клеток, позволяя им сохранять и поддерживать функциональные способности даже при очень высоких уровнях облучения.

Репарация хромосом. Еще в 1950-е гг. было выдвинуто предположение о возможности восстановления радиационных повреждений хромосом. Оно было основано на множестве экспериментальных данных о существенной зависимости количества аберраций хромосом на клетку от длительности интервала

между фракциями дозы. Но если при небольших интервалах, измеряемых минутами-часами, практически всегда наблюдается уменьшение числа аберраций, свидетельствующее о процессах восстановления, то при последующем увеличении времени между фракциями или количества фракций результаты оказываются довольно противоречивыми: в одних случаях обнаруживается ожидаемое монотонное их уменьшение до определенного постоянного уровня, в других – после уменьшения наблюдается вновь увеличение. На рис. 15.5 схематически изображены эти зависимости. Практически все имеющиеся в литературе экспериментальные данные, полученные в опытах с растениями и животными, описываются либо кривой типа 1, либо кривой типа 2, получившей название кривой Лейна (по имени автора, впервые обнаружившего такую зависимость).

Не менее многочисленным является­ экспериментальный материал об уменьшении количества аберраций хромосом с увеличением интервала между облучением и временем их подсчета в пределах одного клеточного цикла.

В целом считается доказанным, что в пострадиационный период может осуществляться восстановление хромосом. Но очень трудно говорить о каком-либо определенном механизме их репарации, потому что восстановление хромосом, визуально наблюдаемое обычно как уменьшение количества их аберраций или других нарушений, несомненно, представляет собой более сложный процесс, чем восстановление отдельных молекул ДНК и хроматина. Структурная организация хромосом, в особенности эукариотов, весьма сложна. Помимо нитей ДНК в их состав входят определенное количество РНК, разнообразные белки, с которыми нуклеиновые кислоты образуют прочные связи. Трудно представить, чтобы электронный трек мог разрушить такую структуру. Еще труднее вообразить механизм ликвидации данных повреждений в процессе восстановления, который должен одновременно охватывать все перечисленные компоненты хромосом. Хотя и не исключено, что в восстановлении аберраций хромосом определяющим является именно повреждение ДНК, скорее всего в виде двойных разрывов, а в основе восстановления лежит именно восстановление этих разрывов по рассмотренным выше схемам.

Рис. 15.5. Схематическое изображение двух типов зависимости повреждения хромосом от интервала времени между фракциями дозы облучения.

Предполагается, что определенную роль в пострадиационном восстановлении хромосом могут играть теломеры – концевые участки хромосом, предохраняющие их от слипания и тем самым сохраняющие их целостность. При разрыве хромосомы в результате облучения в местах разрыва возникают новые теломеры, стабилизирующие структуру и, возможно, функции хромосом.

Априори следует считать, что в репарации хромосом важная роль принадлежит репарации хроматина, их составляющего.

Репарация клеточных мембран. Облучение живых организмов ионизирующей радиацией нарушает целостность и функции клеточных мембран. Это проявляется в первую очередь в изменении мембранного потенциала, активности многих ферментов, связанных с мембранами, увеличении проницаемости мембран. В последующем – приводит к нарушению компартментализации фондов отдельных метаболитов, анормальным выходам из клеток различных веществ и их пространственному перераспределению, что в итоге обусловливает существенные нарушения метаболизма даже при относительно невысоких дозах облучения. В свое время определенной популярностью у радиобиологов пользовалась «теория высвобождения ферментов», связывающая механизм действия радиации именно с повреждением мембран, увеличением их проницаемости и нерегулируемой деятельностью ферментов. Некоторые ее аспекты не утратили актуальности и сейчас. Более того, считается, что при малых дозах радиации, когда повреждения ДНК успешно репарируются, радиационное поражение обусловлено именно повреждением мембран.

Однако имеются данные о том, что структура мембран и ее проницаемость, поврежденные ионизирующей радиацией, могут восстанавливаться с течением времени после облучения. Считается, что восстановление структуры мембран состоит в устранении поврежденных белково-липидных компонентов с их последующей заменой неповрежденными молекулами. В основе этого процесса лежит естественное постоянное обновление мембран за счет так называемого мембранного потока – постоянного переноса мембранного материала из структур эндоплазматического ретикулума в плазматические мембраны и выноса окисленных компонентов из мембран в цитозоль. Мембранный поток обеспечивает антиоксидантную защиту клеток при перекисном окислении липидов – химическом процессе, играющем важную роль в регуляции клеточного метаболизма в норме.

Облучение ионизирующей радиацией нарушает гомеостаз в этой системе в первую очередь за счет усиления перекисного окисления липидов, что индуцирует активацию антиоксидантной защиты и, соответственно, повышение мембранного потока. При этом на места выщепленных поврежденных фрагмен-

тов мембран встраиваются новые липидные молекулы и другие компоненты мембран. Таким путем, согласно современным представлениям, осуществляется репарация мембран.

15.2. Репопуляционное восстановление

Радиоустойчивость многоклеточных систем, какими являются популяции стволовых клеток критических органов, не может быть однозначно связана с индивидуальной радиоустойчивостью составляющих ее клеток. В таких тканях развитие радиационного поражения в значительной мере зависит не только от способности отдельных клеток к репарационному восстановлению, но и от особенностей клеточно-популяционных взаимодействий в ткани, в основе которых лежит гетерогенность клеток в отношении их индивидуальной радиоустойчивости. Подобная гетерогенность в первую очередь обусловлена асинхронностью клеточных делений в образовательных тканях, следствием чего является наличие в активно делящейся популяции клеток на разных фазах клеточного цикла, обладающих различной радиоустойчивостью, и существования особых клеток или целых участков ткани, находящихся вне цикла (out of cycle), в своеобразном покое. Именно эти клетки, сохранившие способность к делению при облучении, наряду с клетками, репарировавшими повреждение, являются источником репопуляционного восстановления критических тканей и органов.

15.2.1.Природа гетерогенности клеточных популяций

иасинхронности деления клеток

Любая популяция клеток – одиночных или клеток в составе ткани – представляет собой гетерогенное образование. Клетки различаются по форме, размерам, диаметру, а следовательно, объему клеточных ядер. В совершенно однородной, на первый взгляд, корневой меристеме объем клеточных ядер варьирует в очень широком диапазоне: у конских бобов в пределах 398–1177, гороха – 343–1331, ячменя – 216–1000 мк3. Клетки с меньшими ядрами, как правило, отличаются и меньшими размерами. Сходные результаты получены при анализе популяций клеток критических тканей животных. Более того, даже у пар сестринских клеток, образующихся при митотическом делении, практически никогда не наблюдается абсолютная идентичность в параметрах. Это обусловлено местом расположения клетки в ткани, ее ориентацией, разным влиянием соседних клеток и другими факторами.

Но для того, чтобы разделиться вновь, клетка должна достичь определенных параметров, определяемых объемами необходимых метаболитов. Для клеток, различающихся по первичным показателям, для этого требуется разное время, т.е.

такие клетки будут отличаться продолжительностью клеточного цикла. Именно поэтому все клеточные популяции делятся асинхронно. У клеток эмбрионов, например, на первых этапах развития наблюдается некоторая синхронность деления. Но уже на третьем-четвертом цикле, а иногда и раньше, наступает десинхронизация. При искусственной синхронизации деления с помощью воздействия на клетки специфических физических (температура), химических факторов либо путем механического отбора клеток, находящихся в определенной фазе клеточного цикла (последнее возможно лишь для суспендиальной культуры клеток), относительно высокая степень синхронности деления достигается также на протяжении всего одногодвух циклов. С каждым последующим циклом деления степень асинхронности возрастает, в результате чего очень быстро наступает полная десинхронизация деления клеток.

Таким образом, критические ткани и органы растений и животных, которыми являются их постоянно обновляющиеся образовательные ткани, представляют собой асинхронно делящиеся популяции клеток, находящихся на различных фазах цикла деления и отличающихся, как отмечалось в главе 7, своей радиочувствительностью. Это является определяющим обстоятельством, обусловливающим наличие в асинхронно делящихся популяциях образовательных тканей в любой момент времени, наряду с радиочувствительными – клеток, обладающих высокой радиоустойчивостью. Эти клетки и представляют собой один из источников репопуляционного восстановления популяций в постра­диационный­ период. Именно поэтому асинхронность деления чувствительных ко всякого рода повреждениям постоянно делящихся клеток образовательных тканей следует рассматривать как эволюционно сформировавшуюся способность, свойство, обеспечивающее надежность их функционирования­ при воздействии неблагоприятных факторов.

15.2.2. Радиоустойчивость покоящихся клеток

Как уже упоминалось, в определенных ситуациях под влиянием как внутренних регуляторных механизмов, так и разнообразных внешних воздействий прохождение клеткой последовательных циклов деления может приостанавливаться, и клетка в этом случае оказывается вне цикла, переходя в состояние покоя. Покоящиеся клетки по совершенно понятным причинам должны обладать повышенной по сравнению с пролиферирующими устойчивостью к повреждающим воздействиям. И хотя однозначных прямых доказательств повышенной радиоустойчивости покоящихся клеток относительно немного, об этом часто говорится как о чем-то само собой разумеющемся. Имеется немало данных, полученных в исследованиях с критическими органами млекопитающих, меристемами растений, различны-