21. Оценки иммунного статуса организма человека (клинико-лабораторные методы).

Оценка иммунного статуса  начинается с ОРИЕНТИ­РОВОЧНОГО КЛИНИЧЕСКОГО (ПЕРВОГО) ЭТАПА – соби­рают и оценивают иммунологический анамнез: частоту инфекцион­ных заболеваний, характер и выраженность их течения, наличие очагов хрон инфекции. Оцениваются результаты клинического анализа крови: содержа­ние гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов. С помощью бактерио­логических, вирусологических и серологических исследований выявляется бактерио- или вирусоносительство.

На ВТОРОМ ЭТАПЕ В иммунологической ЛАБОРАТОРИИ проводит­ся исследование крови с использованием иммунологических тес­тов 1-го и 2-го уровней.

Тесты 1-го уровня позволяют выявить грубые наруше­ния со стороны иммунной системы, в крови определяют процентное содержание и абсолютное кол-во Т- и В-лим­фоцитов.

Для подсчета Т-ЛИМФОЦИТОВ используют реакцию розеткообразования с эритроцитами ба­рана (Е-РОК). У здоровых людей количество Т-лимфоцитов (Е-РОК) среди всех лимфоцитов периферической крови составляет 40–70%. Более точные методы – выявление Т-лимфо­цитов с помощью специфических анти-Т-сывороток (например, с использованием меченых моноклональных АТ в иммунофлюоресцентном тесте).

Тесты для количественного подсчета В-ЛИМФОЦИТОВ основаны на обнаружении некоторых поверхностных маркеров, к/х нет на Т-, но есть на В-лимфоцитах (по­верхностных Ig, С3- рецепторов, специфических В-АГ). Количество В-лимфо­цитов определяется по наличию на них рецепторов к СЗ-компоненту комплемента методом ЕАС–розеткообразующих клеток (ЕАС-РОК), которое в норме составляет 10–30% общего числа лимфоцитов.

Для определения кон­центрации СЫВОРОТОЧНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IgM, IgG и IgA (по Манчини) испольуется реакция преципитации в геле (тест иммунодиффузии) между АТ исследуемой сыворот­ки и АТ к IgM, IgG и IgA. Уровень сывороточных Ig отражает состояние В-системы иммунитета.

Для оценки факторов неспецифической защиты определяют ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ крови. О фаго­цитарной активности судят по проценту фагоцитирующих клеток и среднему количеству микробных частиц, поглощенных одним лейкоцитом.

Тесты 2-го уровня позволяют провести более тщатель­ный анализ иммунного статуса организма человека, позволяют уточнить характер дефекта, выявленного на предыду­щем этапе с помощью ориентировочных тестов. К ним относят определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов (Т-хелперы / Т-супрессоры), оценку функциональной активности регуля­торных и эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов и др. Боль­шинство тестов 2-го уровня весьма трудоемки, результаты их мо­гут быть получены не ранее чем через 3–7 сут.

22. Реакция агглютинации, непрямой гемагглютинации

Агглютинацией называется склеивание бактерий при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Ее используют: 1) для определения вида и серовара выделенных бактерий (СЕРОТИПАЖ), 2) для обнаружения антител в сыворотке крови больного (СЕРОДИАГНОС­ТИКА).

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компо­нента: Аг (агглютиноген), Ат (агглютинин) и электролит (изотонический раствор натрия хлорида). В качестве Аг в РА применяют взвеси живых и убитых бактерий (ДИАГНОСТИКУМЫ).

Для получения агглютинирующих сывороток обычно иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2–7 суток в возрастающих дозах вводят взвесь убитых, а в конце – 2–3 раза живых бактерий. Через неделю после иммунизации определяют титр сыворотки, или максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки не­достаточен, иммунизацию продолжают. Полученные таким образом аг­глютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для опред-я вида б!! надо ставить развернутую реакцию с сыво­роткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует мк-му в том случае, если как минимум агглютинирует его до половины титра.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вслед­ствие чего нет необходимости разводить их. Реакцию агглютинации в них ставят на предметном стекле.

Ориентировочная, или пластинчатая, реакция агглютинации. Ориен­тировочную РА выполняют перед постановкой развернутой реакции для того, чтобы отобрать на среде агглютинирующиеся в сыворотке колонии бактерий (культуры) и исключить из дальнейших исследований неагглютинирующиеся. Ставят ее при комнатной температуре на предметном стекле. Для этого на его поверхность пастеровской пипеткой раздельно наносят 2–3 капли различных сывороток в разведениях 1:10–1:20 и кап­лю 0,5% раствора NaCl (контроль РА). В каждую каплю за исключением контрольной вносят подозрительные колонии (петлю куль­туры) и тщательно перемешивают до равномерного помутнения.

Результаты реакции учитывают через несколько минут невооружен­ным глазом. При положительной реакции в каплях с сывороткой появляются крупные или мелкие хлопья, при от­рицательной – жидкость остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации для идентификации бактерий.

Ставят ее следующим образом. В агглютинационные пробирки предва­рительно разливают по 1 мл изотоничес­кого раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разве­денной 1:100, и, смешав ее, 1 мл перено­сят во вторую, из второй – в третью пробирку и т. д. Получив двукратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более), вносят в них по 1–2 капли двухмиллиардной взвеси бактерий. Кон­тролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуе­мая сыворотка без него. Пробирки энер­гично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37С, затем ведут предварительный учет, начиная с контрольных. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взве­шенных хлопьев в двух–трех и более про­бирках опыта свидетельствуют о положи­тельной реакции. Оконча­тельные результаты учитывают через 18–20ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка проз­рачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++» «++» и «+» – убывающие просветления с уменьшением бак­териального осадка.

Реакция агглютинации для серодиагностики инфекционных болезней.

При использовании РА для выявления в сыворотке больных антител к соответствующему патогенному микробу или, как кратко говорят, в целях серодиагностики берут 5 мл крови, получают сыворотку и разводят ее изотоническим раствором натрия хлорида от 1:50–1:100 до 1:800–1:1600, так как в более низких ее титрах могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или у больных с другим диагнозом.

В качестве Аг в этой реакции используют заведомо известные взвеси убитых мк (ДИАГНОСТИКУМЫ), с которыми безопасно работать

РА для серодиагностики ставится и учитывается так же, как и раз­вернутая РА для определения вида бактерий. Диагностическое значение имеют титры 1:100–1:200 и выше.

Более достоверные результаты дает выявление нарастания титра ан­тител в парных сыворотках, полученных от больного в начале заболе­вания и спустя 3–5 суток и более, когда титр агглютининов повышается под воздействием находящегося в организме патогенного микроба.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару­жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч­ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай­шим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабаты­вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро­цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу­говицы»