Работа 5. Определение липидов в кормовых дрожжах

Цель работы:ознакомление с технологией экстракционного извлечения липидов из биомассы микроорганизмов, закрепление навыков проведения экстракции, определение полноты выделения липидов из биомассы и их содержания в готовом продукте.

Липиды большая группа природных веществ, разнообразных по химической структуре и физико-химическим свойствам. Имеется несколько трактовок понятия липиды и различных схем их классификации.

Под липидами в производстве микробного белка подразумеваются все растворимые в неполярных растворителях компоненты клеток микроорганизмов.

Липиды в клетках микроорганизмов выполняют многие чрезвычайно важные функции. Они входят в состав клеточной мембраны, митохондрий, клеточной стенки, хлоропластов и других органелл. Липопротеиновые комплексы играют важную роль в процессах метаболизма. С ними в значительной мере связаны активный перенос различных веществ через мембраны и распределение этих веществ внутри клетки. С составом липидов во многом связаны такие свойства организмов как термолерантность и термофильность, психрофильность, кислотоустойчивость, вирулентность и другие признаки. Кроме того, липиды могут выполнять функции запасных веществ.

Общее количество липидов у микроорганизмов обычно колеблется от 0,2 до 40 % от абсолютно сухих веществ клетки. К числу микроорганизмов, богатых липидами, т.е. содержащих более 10 % от сухой биомассы клетки, принадлежат дрожжи, микобактерии и коринебактерии. В условиях метаболизма, благоприятных для накопления этих продуктов, содержание липидов может достигать 60—70 % от сухих веществ.

Для направленного биосинтеза липидов используются среды бедные азотом, но богатые углеводами. Установлено, что для углеводного сырья соотношение N:С = 1:40, а для углеводородного 1:30.

Условия культивирования (рН, температура, аэрация) также оказывают существенное влияние на количество и фракционных состав синтезируемых липидов. В процессе культивирования микроорганизмов на различных субстратах можно получить все классы липидов:

• простые липиды (нейтральные жиры, воски);

• сложные липиды (фосфолипиды, гликолипиды);

• производные липидов (жирные кислоты, спирты, углеводороды, витамины Е, К).

Липиды микроорганизмов после их выделения и соответствующей обработки могут быть использованы в различных отраслях промышленности, высвобождая для пищевых целей значительное количество жиров растительного и животного происхождения.

В промышленных условиях микробные липиды выделяют из сухой биомассы дрожжей, полученной при их культивировании на гидролизатах растительного сырья, торфа или углеводородах нефти, методом экстракции.

Экстракционное отделение включает в себя как оборудование для самого процесса экстракции, так и для стадий регенерации растворителя. В процессе экстракции параллельно получают два ценных продукта — обезжиренную микробную биомассу (биошрот) и липиды (биожир).

Проведение испытания

В сухую коническую (качалочную) колбу помещают около 2 г кормовых дрожжей, предварительно взвешенных с точностью до 0,01 г. Затем добавляют 100 мл предварительно подготовленной экстракционной смеси, состоящей из 75 % петролейного эфира, 20 % пропанола, 5 % дистиллированной воды. Колбу закрывают ватным тампоном или пробкой, подписывают, ставят на качалку и проводят экстракцию липидов в течение 1,5—2 ч при температуре 35—40 °С.

По окончании процесса экстракции колбу снимают с качалки, содержимоеколбы фильтруют в предварительно взвешенную с точностью до 0,002 г чистуюкруглодонную колбу емкостью 250 мл через складчатый фильтр. Остаткибиомассы из качалочной колбы смывают на фильтр 30 мл свежей экстракционной смеси.

Выделение липидов из раствора (мисцеллы) проводят с помощью отгонки растворителя на роторно-пленочном испарителе под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом.

После отгонки растворителей круглодонную колбу с биожиром отсоединяют от прибора и помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 105 °С, выдерживают при этой температуре 30—40 мин для полного удаления растворителей. Затем колбу охлаждают в эксикаторе, взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,002 г и определяют количество проэкстрагированных липидов.

Оставшийся после экстракции и фильтрования биошрот в месте с фильтром помещают в чашку Петри, сушат в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1,5—2 ч, затем охлаждают в эксикаторе, взвешивают биошрот с точностью до 0,01 г и составляют материальный баланс процесса экстракции.

Параллельно проводят определение содержания липидов в биомассе с применением кислотного гидролиза. Для этого в круглодонную колбу емкостью 100 мл помещают около 2 г кормовых дрожжей, предварительно взвешенных с точностью до 0.001 г, из той же партии, которая использовалась для экстракции. В колбу добавляют 2—3 мл пропанола, 10 мл разбавленной (2:1) соляной кислоты, а затем содержимое колбы тщательно перемешивают.

Колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают реакционную смесь на водяной бане при 75 °С в течение 1 ч. Затем в колбу через обратный холодильник добавляют 10 мл пропанола, колбу снимают с бани и оставляют для охлаждения. После охлаждения содержимое колбы переливают в делительную воронку, смывая остатки гидролизата со стенок колбы 20 мл диэтилового эфира. Смесь в воронке энергично встряхивают в течение 1 мин, добавляют 20 мл петролейного эфира и снова встряхивают в течение 1 мин.

После расслаивания отделяют кислотный слой, сливая его обратно в круглодонную колбу, а эфирный слой переливают в чистую делительную воронку. Экстракцию кислотного слоя проводят еще дважды, используя каждый раз 15 мл диэтилового и 15 мл петролейного эфира.

По окончании экстракции реакционную смесь сливают в канализацию, а объединенный эфирный экстракт дважды промывают в делительной воронке дистиллятом порциями по 20 мл, каждый раз встряхивая смесь 30-40 с.

Эфирный экстракт фильтруют через складчатый фильтр в предварительно взвешенную с точностью до 0,002 г круглодонную колбу емкостью 100 мл. Фильтр промывают, начиная с верхних краев, 10 мл смесью диэтилового и петролейного эфиров в соотношении 1:1.

Дальнейшая отгонка растворителей и определение оставшихся липидов проводится в описанной выше методике.