3.2.2 Рибофлавин

В медицинской практике применяют рибофлавин и рибофлавина натрия фосфат (рисунок 16). Для определения сопутствующих примесей рибофлавина используют жидкостную хроматографию. Испытания проводят с защитой от яркого света.

Готовят 3 раствора:

Рисунок 16 – Рибофлавина натрия фосфат

испытуемый раствор: 0,1 г испытуемого образца растворяют в 50 мл воды и доводят подвижной фазой до объема 100,0 мл. 8,0 мл полученного раствора доводят подвижной фазой до объема 50,0 мл;

раствор сравнения (а): 60 мг рибофлавина растворяют в 1 мл кислоты хлористоводородной и доводят водой до объема 250,0 мл. 4,0 мл полученного раствора доводят подвижной фазой до объема 100,0 мл;

раствор сравнения (в): 0,1 г рибофлавина натрия фосфата растворяют в 50 мл воды и доводят объем подвижной фазой до 100,0 мл. 8,0 мл полученного раствора доводят подвижной фазой до объема 50,0 мл.

Условия хроматографирования:

колонка, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии;

подвижная фаза: метанол – раствор калия дигидрофосфата (150:850);

скорость подвижной фазы: 2 мл/мин;

спектрофотометрический детектор, длина волны 266 нм;

объем вводимой пробы: 100 мкл;

время хроматографирования: до полного выхода пика рибофлавина.

Относительное удерживание (по отношению рибофлавина 5´-монофосфату, время удерживания – около 20 мин)

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения (в):

разрешение: не менее 1,5 между пиком рибофлавина 4´-монофосфата и пиком рибофлавина 5´-монофосфата.

Содержание свободного рибофлавина и рибофлавина в форме дифосфатов рассчитывается в процентах исходя из площадей пиков хроматограмме испытуемого раствора и количества свободного рибофлавина в растворе сравнения (а).

Содержание свободного рибофлавина должно быть не более 6,0% в пересчете на сухое вещество.

Содержание рибофлавина в форме дифосфатов должно быть не более 6,0% в пересчете на сухое вещество [14].

3.2.3 Аскорбиновая кислота

Применяют в качестве лекарственного средства кислоту аскорбиновую. Для определения сопутствующих примесей аскорбиновой кислоты применяют жидкостную хроматографию. Растворы готовят непосредственно перед использованием. Готовят:

фосфатный буферный раствор: 6,8 г дигидрофосфата растворяют в воде и доводят до объема около 175 мл этим же растворителем, фильтруют и доводят водой до объема 1000 мл;

испытуемый раствор: 0,5 г испытуемого образца растворяют в подвижной фазе и доводят до объема 10,0 мл эитм же растворителем;

раствор сравнения (а): 10 мг аскорбиновой кислоты примеси С (D - сорбосоновая кислота) растворяют в подвижной фазе и доводят до объема 5,0 мл этим же растворителем;

раствор сравнения (в): 2,5 мл раствора сравнения (а) доводят подвижной фазой до объема 100,0 мл;

раствор сравнения (с): 1,0 мл испытуемого раствора доводят подвижной фазой до объема 200,0 мл.к 1,0 мл полученного раствора прибавляют 1,0 мл раствора сравнения (а);

Условия хроматографирования:

колонка, заполненная силикагелем аминопропилсилильным для хроматографии;

температура 45º С;

подвижная фаза: фосфатный буферный раствор – ацетонитрил (30:70);

скорость подвижной фазы: 1,0 мл/мин;

спектрофотометрический детектор, длина волны 210 нм;

объем вводимой пробы: по 20 мкл испытуемого раствора и растворов сравнения (в) и (с);

время хроматографирования: 2-кратное время удерживания аскорбиновой кислоты.

Относительное удерживание (по отношению к аскорбиновой кислоте, время удерживания – около 8 мин): примесь С – около 1,4.

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения (с):

разрешение: не менее 3,0 между пиками аскорбиновой кислоты и примеси С.

Предельное содержание примесей:

примесь С (не более 0,1%): на хроматограмме испытуемого раствора площадь пика примеси С (D – сорбосоновая кислота (рисунок 17)) не должна превышать площадь соответствующего пика на хроматограмме раствора сравнения (в);

неспецифицированные примеси ( не более 0,1%): на хроматограмме испытуемого раствора площадь любого пика, кроме основного и пика примеси С, не должна превышать площадь пика примеси С на хроматограмме раствора сравнения (в);

Рисунок 17 - D – сорбосоновая кислота

сумма примесей (не более 0,2%): на хроматограмме испытуемого раствора площадь любого пика, кроме основного, не должна превышать 2-кратную площадь примеси С на хроматограмме раствора сравнения (в).

На хроматограмме испытуемого раствора не учитывают пики с площадью менее 0,5 площади пика примеси С на хроматограмме раствора сравнения (в) (0,05%) [14].