3.1.3 Индентификация отдельных водорастворимых витаминов

В настоящее время, согласно методикам, приведенным в Государственной фармакопеи республики Беларусь, каждый витамин определяется отдельно [12].

Для идентификации фолиевой кислоты используют тонкослойную хроматографию. Готовят:

испытуемый раствор: 50 мг испытуемого образца растворяют в смеси из раствора аммиака концентрированного и метанола (2:9) и доводят до объема 100,0 мл этой же смесью растворителей;

раствор сравнения: 50 мг фолиевой кислоты растворяют в смеси из раствора аммиака концентрированного и метанола (2:9) и доводят до объема 100,0 мл этой же смесью растворителей.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GP.

Подвижная фаза: раствор аммиака концентрированного – пропанол – 96% спирт (20:20:60).

Наносимый объем пробы: 2 мкл.

Фронт подвижной фазы: не менее ¾ высоты пластинки.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.

Результаты: на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается пятно, соответствующее по расположению, флуоресценции и размеру основному пятну на хроматограмме раствора сравнения [14].

Для идентификации цианкобаламина также используют тонкослойную хроматографию. Испытания проводят с защитой от света. Готовят:

испытуемый раствор: 2 мг испытуемого образца растворяют в 1 мл смеси 96% спирт – вода (1:1);

раствор сравнения: 2 мг цианкоболамина растворяют в 1 мл смеси 96% спирт – вода (1:1).

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GP.

Подвижная фаза: раствор аммиака разведенный – метанол – метиленхлорид (9:30:4%) (камеру не насыщают парами подвижной фазы).

Наносимый объем пробы: 10 мкл.

Фронт подвижной фазы: не менее 12 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку просматривают при дневном свете.

Результаты: на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается основное пятно, соответствующее по расположению, цвету и размеру основному пятну на хроматограмме раствора сравнения [14].

3.2 Применение хроматографии для определения сопутствующих примесей водорастворимых витаминов

В настоящее время, согласно методикам, приведенным в Государственной фармакопеи республики Беларусь, каждый витамин определяется отдельно [12].

3.2.1 Тиамин

В медицинской практике применяют тиамин в виде солей: тиамина бромид и тиамина хлорид (рисунок 15). Для определения сопутствующих примесей

тиамина используют жидкостную хроматографию. Для этого готовят 4 раствора:

Рисунок 15 – Тиамина хлорид

раствор А: к 95 объемам воды прибавляют 5 объемов кислоты уксусной ледяной и перемешивают;

испытуемый раствор: 0,35 г испытуемого образца растворяют в 15,0 мл раствора А и доводят водой до объема 100,0 мл;

раствор сравнения (а): 5 мг испытуемого образца и тиамина примеси растворяют в 4 мл раствора А и доводят водой до объема 25,0 мл. 5 млм полученного раствора доводят водой до объема 25,0 мл;

раствор сравнения (в): 1,0 мл испытуемого раствора доводят водой до объема 50,0 мл. 5,0 мл полученного раствора доводят водой до объёма 25,0 мл.

Условия хроматографирования:

Колонка, заполненная силикагелем октадецилсилильнымэндкепированным для хроматографии;

температура 45º С;

подвижная фаза А: раствор натрия гексансульфоната, доведенный кислотой фосфорной до рН 3,1;

подвижная фаза В: метанол;

скорость подвижной фазы: 1,0 мл/мин;

спектрофотометрический детектор, длина волны 248 нм;

объем вводимой пробы: 25 мкл.

Относительное удерживание (по отношению к тетризолину, время удерживания – около 12 мин): примесь α-цианотетралин – около 0,5.

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения:

отношение сигнал/шум: не более 50 для основного пика.

Предельное содержание примесей:

любая примесь (не более 0,4 %): на хроматограмме испытуемого раствора площадь любого пика, кроме основного, не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (в).

сумма примесей ( не более 1%): на хроматограмме испытуемого раствора сумма площадей всех пиков, кроме основного, не должна превышать 2,5-кратную площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (в).

На хроматограмме раствора не учитывают пики с площадью менее 0,125 площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения (в) (0,05%) [14].