Андреева, СД методы исследования печени

81

3.3Лабораторные методы диагностики

3.3.1Биохимический анализ функциональной деятельности пече-

ни

А.Тесты на цитолиз

Эти тесты отражают биохимические изменения, связанные с повреждением гепатоцитов (частичная или полная деструкция печеночных клеток). Повреждение гепатоцитов может иметь инфекционную, паразитарную, токсическую и механическую природу.

1. Определение активности трансаминаз в сыворотке

Тест применяется для ранней диагностики заболеваний печени. В основном используется определение количественного содержания в сыворотке крови двух трансаминаз: аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ).

Ферменты-трансаминазы являются белками, локализованными внутри клеток, поэтому в сыворотке их активность низка. При повреждении клеток находящиеся в них ферменты выходят в кровь, где соответствующая ферментативная активность резко возрастает.

Трудность состоит в том, что эти ферменты не являются строго органоспецифичными. Повышение активности трансаминаз, помимо заболеваний печени, может наблюдаться при заболеваниях миокарда. Для заболеваний печени более характерным является изменение активности АЛАТ. Изменение активности АСАТ более выражено при заболеваниях миокарда. Особенно это справедливо для собак, у которых АСАТ в печени отсутствует, поэтому определение активности этого фермента для диагностики заболеваний печени у данного вида животных не целесообразно.

АЛАТ широко распространен в тканях, особенно много его в печени, что имеет важное диагностическое значение при заболеваниях этого органа.

Увеличение АЛАТ происходит при острых гепатитах, механической желтухе, циррозе печени, введении гепатотоксических препаратов. При заболеваниях печени увеличение содержания этого фермента в крови происходит за 1-4 недели до развития клинических признаков и за 7-10 дней до обнаружения повышения уровня билирубина в крови.

АСАТ находится в клетках сердца, печени, скелетной мускулатуры. Увеличение в 4-5 раз происходит при поражении миокарда, при заболеваниях печени. Для дифференциальной диагностики используется отношение активности этих ферментов АсАТ/АлАТ, называемое коэффициентом де Ритиса. В норме этот коэффициент у жвачных животных составляет 1,3. У плотоядных животных этот коэффициент близок к единице.

Увеличение коэффициента наблюдают при поражениях сердца, уменьшение – при заболеваниях печени.

При оценке результатов исследования (табл.1) следует иметь в виду,

82

что стероидная терапия понижает активность ферментов (и снова возрастает после отмены); снижение активности ферментов запаздывает по сравнению со снижением нормы билирубина и ликвидацией клинических признаков, т.е. полное выздоровление можно констатировать только после нормализации ферментемии; при хронических гепатитах и циррозах снижение активности ферментов не всегда является благоприятным признаком и может свидетельствовать об уменьшении их синтеза в результате развития ГЦН.

Таблица 1 - Содержание ферментов АсАТ и АлАТ в сыворотке крови разных видов животных (ЕД/л или u/L)

2. Определение количества билирубина в сыворотке

Билирубин – желчный пигмент, образуется в клетках РЭС из гемоглобина разрушенных эритроцитов. Билирубин ядовит, нерастворим в воде и не выделяется почками. В крови он образует непрочный комплекс с альбумином, благодаря чему токсичность его снижается. Такой билирубин называют свободным или непрямым (неконъюгированным). В печени происходит экстракция билирубина из комплекса с альбумином и соединение (конъюгирование) его с глюкуроновой кислотой. Соединения билирубина с глюкуроновой кислотой – моно- и диглюкурониды растворимы в воде и называются прямым (связанным) билирубином, который выделяется в желчь и поступает в кишечник, где превращается в уробилиноген.

В сыворотке крови здоровых животных содержится только непрямой билирубин. Для диагностики заболеваний определяют общий, прямой и непрямой билирубин (табл.2). Количественное определение билирубина в сыворотке проводят методом Ендрашика или Бокальчука.

Повышение уровня общего билирубина в сыворотке (билирубинемия) может быть в результате усиленного гемолиза эритроцитов, нарушениях оттока желчи в кишечник (холестаз), поражениях паренхимы печени с нарушением билирубиновыделительной функции печени. При острых процессах уровень билирубина может возрастать в 20 раз и более, при хронических – в 2-10 раз. У кошек и собак повышение содержания билирубина до 1-2 мг% сопровождается желтухой.

83

Таблица 2 - Содержание общего билирубина в сыворотке крови разных видов животных

Примечание: коэффициент пересчёта 17,10.

Для дифференциации указанных причин билирубинемии проводят качественные реакции по Ван ден Бергу. Реакция качественного определения билирубина по Ван ден Бергу основана на том, что при добавлении смеси диазореактивов к сыворотке крови, содержащей билирубин, образуется диазосоль (азобилирубин), который придает сыворотке розовато-сиреневое окрашивание. Для проведения реакции берут две пробирки. Реактивы и их объём указаны в таблице 3.

Таблица 3 - Объёмы реактивов для проведения прямой и непрямой реакции

Состав диазореактивов:

№1 – сульфаниловая кислота – 1,0; соляная кислота – 10,0; дистиллированная вода - 200,0.

№2 – азотнокислый натрий – 0,5; дистиллированная вода -100,0.

Смесь диазореактивов готовят из 5,0 мл реактива № 1 и 0,15 мл реактива № 2.

Учет реакции проводят через 5 минут:

+ реакция розово-сиреневое окрашивание; - реакция – нет окраски.

Свободный билирубин дает с диазореактивом непрямую реакцию, т.к. окрашивание происходит только после добавления аксельратора - 96 0 спир-

84

та. Связанный билирубин дает прямую реакцию, т.е. окрашивание происходит сразу при добавлении диазореактивов.

Патология:

непрямая ++++ - гемолитическая желтуха;

прямая быстрая ++++ - механическая желтуха;

прямая замедленная (через 10-15 мин) +++ - паренхиматозная желтуха.

При гемолитической желтухе реакция всегда непрямая (т.к. в сыворотке содержится свободный билирубин); при механической желтухе (холестазе) реакция всегда прямая (т.к. в сыворотке содержится связанный билирубин); при паренхиматозной желтухе реакция на билирубин, как правило, прямая (т. к. в сыворотке содержится связанный билирубин, который проникает в кровь в результате цитолиза). При увеличении тяжести процесса нарушается способность печени конъюгировать свободный билирубин (развивается ГЦН), количество свободного билирубина в сыворотке нарастает и реакция может быть непрямой.

3. Определение желчных кислот в моче

Определение желчных кислот в моче проводят реакцией с серным цветом по Гай - Крафту.

Методика реакции: на поверхность мочи, налитой в пробирку, насыпают небольшое количество сухого порошка серного цвета. Быстрое погружение серного цвета на дно пробирки указывает на содержание в моче 0,01 % и более желчных кислот. При отрицательной реакции серный цвет плавает по поверхности.

В моче могут находиться холевая и таурохолевая кислоты. У здоровых животных концентрация этих кислот в моче не превышает 0,01 %. Появление их в моче свидетельствует о механической или паренхиматозной желтухе (гепатиты, циррозы, портальная гипертензия, желчекаменная болезнь). Желчные кислоты в моче здоровых животных не определяются. Положительная реакция на желчные кислоты свидетельствует о повышенном их содержании в моче 0,01% и более. При гемолитической желтухе желчные кислоты в моче никогда не появляются.

4.Определение билирубина в моче

Вмоче здоровых животных билирубин не содержится. Он выделяется с

мочой только при выраженной билирубинемии (содержание билирубина в сыворотке, превышающее почечный порог, 2мг% и более). Эта закономерность не распространяется на собак, так как у этого вида животных очень низкий порог выведения желчных пигментов и даже незначительная билирубинемия сопровождается билирубинурией.

С мочой может выделяться только связанный билирубин, поэтому

85

билирубинурия наблюдается при паренхиматозной и механической желтухах, сопровождающихся повышением количества связанного билирубина. При этом необходимо учитывать, что у собак в почках некоторое количество свободного билирубина может конъюгироваться в связанный. Поэтому обнаружение следов билирубина при плотности мочи, соответствующей физиологической норме (1,015-1,050 г/мл), у собак не является показателем заболевания печени.

Для определения билирубина в моче используют пробу Розина, пробу Франка, Фуше, а также реактивные полоски для экспресс-диагностики.

Проба Розина (используется для всех видов животных, кроме круп-

ного рогатого скота). Наливают в пробирку 4,0 мл мочи, затем на неё осторожно наслаивают 0,5-1,0 мл 1 %-ного спиртового раствора йода. Положительной реакцией считают появление зеленого кольца на границе жидкостей.

Проба Франка (для крупного рогатого скота). Берут 2,0 мл мочи, до-

бавляют каплю 0,2 %-ного раствора метиленовой синьки. Положительная реакция – зеленый цвет, отрицательная – синий.

Билирубинурия - свидетельство грубых нарушений гепатобиллиарной системы (цитолиз) и наблюдается при:

паренхиматозной желтухе (поражение паренхимы печени);механической желтухе (обтурации желчевыводящих путей).

При гемолитической желтухе реакция мочи на билирубин всегда отрицательная, что имеет значение для дифференциальной диагностики.

5. Определение уробилиногена (уробилиновых тел)

Уробилин определяют качественными пробами по Богомолову или Шлизингеру. У коров для определения уробилина в моче применяют пробу Флоренса. Кроме того, для экспресс-диагностики можно использовать наборы диагностических полосок фирм Boehringer, Mannheim GmBh, Merek, Bayer Laboratories и др.

У здоровых животных в моче содержится небольшое количество уробилина (не более 0,05 - 0,15 мг/л). Качественные пробы дают результат на один крест (+). Повышенное выделение уробилиновых тел (урохромоген, урохром, уроэритрин, уробилин, стеркобилин) с мочой называется уробилинурией.

Уробилинурия наблюдается вследствие ослабления функции печени, которая не в состоянии утилизировать уробилиноген из притекающей к ней крови, или вследствие избыточного поступления уробилиногена из кишечника в печень, которая хотя функционально полноценна, но не успевает задерживать и трансформировать весь поступающий из кишечника уробилиноген, поэтому последний, минуя печень, попадает в ток крови. У кошек и собак повышенное содержание уробилина в моче отмечается также при

86

снижении моторики кишечника и сдвиге рН мочи в щелочную сторону. Уробилинурия встречается при заболеваниях печени (гепатиты, цирро-

зы), гемолитических состояниях (гемолитические анемии, гемоглобинурии), а также при кишечных заболеваниях (энтероколиты, завалы, кишечная непроходимость).

Проба Богомолова. К 10 мл мочи прибавляют 2-3 мл насыщенного раствора сульфата меди, затем несколько капель соляной кислоты для просветления. Через 5 минут прибавляют 2-3 мл хлороформа и взбалтывают. При наличии большого количества уробилина хлороформ окрашивается от розово-красного до медно-красного цвета.

Проба Флоренса. Мочу в количестве 8-10 мл подкисляют в пробирке 8-10 каплями концентрированной серной кислоты, перемешивают, затем приливают 2-3 мл эфира и, закрыв пробирку пробкой, несколько раз осторожно пропускают эфир через слой мочи для экстрагирования уробилина. Затем эфирную вытяжку мочи наслаивают, лучше пастеровской пипеткой, на 2-3 мл концентрированной НСl, налитой в другую пробирку. При наличии уробилина на границе жидкостей образуется розовое кольцо. Интенсивность окраски пропорциональна количеству уробилина. Проба настолько чувствительна, что даже в норме на границе между двумя жидкостями видно легкое розовое окрашивание. Этой пробой можно установить полное отсутствие уробилиноидов в моче.

Проба Шлезингера. К 4-5 мл мочи приливают равное количество реактива Шлезингера (насыщенный спиртовой раствор ацетата цинка - 10 г на 100 мл 96° спирта), реактив предварительно взбалтывают и добавляют одну каплю раствора Люголя. Оставляют на 10 мин, затем фильтруют. Пробирку просматривают на темном фоне в отраженном свете. При наличии уробилина образуется зеленая флюоресценция. Некоторые медикаменты дают положительную пробу Шлезингера. Для разграничения настоящей положительной пробы и медикаментозной прибавляют разведенную соляную или серную кислоту. Флюоресценция, вызванная уробилином, исчезает, медикаментозная остается.

Проба Нейбауэра. К 3-4 мл свежевыпущенной мочи, охлажденной до комнатной температуры, прибавляют 3-4 капли реактива Эрлиха (2 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл 20%-ного раствора соляной кислоты). Окрашивание жидкости в красный цвет в течение первых 30 секунд говорит об увеличенном содержании уробилиногена в моче. Если окрашивание развивается по прошествии 30 секунд, то концентрация уробилина в моче нормальная, а если через 30 секунд окраска не развивается, то это может быть вариантом нормы или можно говорить о полном отсутствии уробилиногена в моче.

Билирубин мешает определению уробилиноидов, поэтому, если он обнаружен в моче, его следует предварительно удалить, осаждая хлоридом ба-

87

рия с последующим фильтрованием. Для этого к 10-12 мл мочи приливают 5-6 мл 10%-ного раствора ВаСl2 и фильтруют. Затем фильтрат проверяют на полноту осаждения билирубина и процедуру повторяют, если первое осаждение было неполным.

B. Тесты на гепатоцеллюлярную недостаточность (ГЦН)

Данная группа тестов отражает биохимические изменения, связанные с нарушением биосинтетической функции печени. В клетках здоровой печени синтезируется большое количество веществ (конъюгируется билирубин, образуются сывороточные протеины, гликоген и др.). Нарушение образования этих веществ свидетельствует о наличии ГЦН.

1. Определение уровня общего белка и его фракций в сыворотке

Печень обладает большими компенсаторными возможностями, поэтому даже при значительных паренхиматозных поражениях количество общего белка в сыворотке может не изменяться длительное время (табл. 4).

Общий белок - это суммарная концентрация всех белков, находящихся в сыворотке крови. Белки крови выполняют многие функции: поддерживают постоянство онкотического давления, рН крови, уровень катионов в ней, играют важную роль в образовании иммунитета, образуют комплексы с углеводами (глюкопротеиды) и липидами (липопротеиды), являются средством транспорта для некоторых веществ. Некоторые гормоны являются по своей структуре белками. Альбумины, -глобулины и фибриноген образуются в печёночных клетках, -глобулины образуются в клетках РЭС, в лимфоцитах. Определение общего белка проводят рефрактометрическим методом или с помощью биуретового реактива.

Уменьшение содержания белка (гипопротеинемия) может быть относительной (при изменении объёма крови в результате водных нагрузок, инфузий большого количества солевых растворов) и абсолютной – при недостаточном поступлении белка с пищей, хронических заболеваниях желудоч- но-кишечного тракта, хронических кровотечениях, протеинурии, заболеваниях печени, туберкулезе. Уменьшение концентрации белка в крови ниже 50 г/л сопровождается гипопротеинемическими отёками тканей.

Таблица 4 – Содержание общего белка в сыворотке крови разных видов животных

88

Увеличение (гиперпротеинемия) бывает значительно реже. Может встречаться при дегидратации организма, при хроническом полиартрите, кетозе, гепатозе, высококонцентратном типе кормления.

Определение уровня общего белка у новорожденных телят позволяет судить о напряженности у них колострального иммунитета, поскольку существует прямая зависимость между содержанием общего белка и иммуноглобулинами. Содержание в сыворотке телят 1-5 дневного возраста 55-70 г/л общего белка указывает на достаточный для защиты новорожденных уровень колострального иммунитета. Меньший уровень протеинемии у телят характеризует иммунодефицитное состояние. Для более точной диагностики определяют соотношение белковых фракций в сыворотке крови (табл.5)

В отличие от уровня общего белка, нарушение соотношения белковых фракций (диспротеинемия) является ранним признаком поражения печени. Соотношение фракций при заболеваниях печени изменяется в сторону уменьшения альбуминов и повышения глобулинов (главным образом - глобулинов).

Таблица 5 - Содержание белковых фракций в сыворотке крови разных видов животных, %

Гиперальбуминемия встречается при дегидратации. Гипоальбуминемия – при алиментарной дистрофии, болезнях печени,

почек, А-гиповитаминозе, пневмониях и бронхопневмониях, туберкулезе, иммунных дефицитах.

Диспротеинемия – нарушение количественного соотношения белковых фракций. Для уточнения диагноза составляют протеинограммы. Выделяют ряд патологических протеинограмм:

1. Тип протеинограммы, соответствующий острым воспалительным процессам, – выраженное уменьшение содержания альбумина и повышенное содержание -глобулинов, в более поздние стадии – возрастание -

89

глобулинов. Характерно для начальной стадии пневмонии, острого полиартрита, плеврита, сепсиса.

2.Тип подострого хронического воспаления – умеренное снижение альбумина, выраженное увеличение -глобулинов и -глобулинов. Характерно для поздней стадии пневмонии, хронического туберкулеза легких, хронического эндокардита, цистита, пиелита.

3.Тип нефротического симптомокомплекса – значительное уменьше-

ние альбумина, умеренное снижение -глобулинов, повышение - глобулинов и -глобулинов. Характерно для липоидного и амилоидного нефроза, нефрита, нефросклероза.

4. Тип злокачественных новообразований – резкое уменьшение альбумина при значительном увеличении всех глобулиновых фракций, особенно-глобулинов. Наблюдают при опухолях и метастазах.

5.Тип гепатитов – умеренное уменьшение альбумина, увеличение - глобулинов и сильное увеличение -глобулинов. Характерно для гепатитов, токсических повреждений печени, гемолиза эритроцитов.

6.Тип цирроза печени – значительное снижение альбумина при силь-

ном увеличении -глобулинов. Встречается при циррозе печени и туберкулезе.

7. Тип механической желтухи – уменьшение альбуминов и умеренное увеличение всех глобулиновых фракций.

Содержание альбуминов снижается по мере нарастания тяжести процесса, накануне гибели животного их количество в 2 раза ниже нормы. Если количество - глобулинов в сыворотке превышает количество альбуминов, то это плохой прогностический признак, свидетельствующий о скорой гибели животного.

Помимо количественного определения белковых фракций применяется ряд простых проб, с помощью которых выявляется наличие диспротеинемии. Это так называемые белково-осадочные пробы. Наибольшее распространение получили сулемовая и тимоловая пробы.

Тимоловая проба имеет большое значение при острых заболеваниях печени. Она бывает положительной у 80 % больных острым гепатитом. В норме степень мутности сыворотки не должна превышать 0-4 ME.

Сулемовая проба чаще бывает положительной при затяжном течении процесса (хронический гепатит, цирроз), но может быть положительной при остром гепатите. Результат сулемовой пробы выражают количеством мл раствора сулемы, пошедшей на титрование. В среднем на титрование идет 1,6-2,6 мл 0,1%-ного раствора сулемы. Уменьшение количества раствора, пошедшего на титрование (менее 1,5 мл), свидетельствует о положительной сулемовой пробе (результат достоверен для сельскохозяйственных животных).

90

2. Определение протромбинового времени

Печень играет доминирующую роль в выработке веществ, активно участвующих в процессе свертывания крови (протромбин, фибриноген, проакцелерин, проконвертин и др.). Учитывая это, естественно предполагать, что заболевания печени сопровождаются нарушением процесса гемостаза (свертывания крови).

Протромбиновое время (ПВ) – это время образования сгустка фибрина в цитратной плазме при добавлении к ней раствора кальция хлорида и стандартизированного тромбопластина, т.е. тромбопластина известной активности (активность принимается за 100 %). Результаты выражают в виде протромбинового индекса (ПИ).

ПВ исследуемого животного

Протромбиновое время здоровых животных составляет в среднем 6-20 сек (табл. 6), протромбиновый индекс – 80-100 %. При заболеваниях печени ПВ увеличивается в 2-4 раза, что свидетельствует о диффузном поражении печени и является плохим прогностическим признаком.

Увеличение протромбинового времени может также наблюдаться при механической желтухе, так как в результате нарушения поступления желчи в кишечник нарушается всасывание витамина К, который необходим для образования факторов протромбинового комплекса.

Таблица 6 - Нормативы протромбинового времени у разных видов животных

3. Проба нагрузкой галактозой

Резервные возможности печени в плане поддержания углеводного обмена очень велики и серьезные нарушения этой функции наблюдаются только при тяжелых поражениях печени. При заболеваниях печени снижается ее способность превращать глюкозу в гликоген. В результате чего вначале может быть выражена гипергликемия (повышение уровня глюкозы в крови), вследствие нарушения утилизации глюкозы. В дальнейшем развивается гипогликемия (снижение уровня глюкозы в крови) вследствие уменьшения печеночного депо углеводов.

Для оценки функции углеводного обмена проводят определение уров-