Биохимия Р.Марри

отнести пациентов с повышенным количеством

экскретируемых уратов.

Таблица 35.2. Классифккация пациентов с гиперурикемией

1. Нормальная экскреция уратов; нарушения функции по­

чек, приводящие к повышению содержания уратов в сы­

воротке.

п. Увеличение количества экскретируемых уратов, обу­ словленное их избыточным образованием

А. Вторичное, обусловленное другими заболеваниями (рак, псориаз)

Б. Недостаточность известных ферментов 1) нарушения функционирования ФРПФ-синтетазы

2) недостаточность гипоксантин-гуанин- фосфори­ бозилтрансферазы

3) недостаточность глюкозо-6-фосфазаты В. Причины нарушений не установлены.

Синдром Леша-Найхана и болезнь Гирке

В некоторых случаях гиперэкскреция уратов (бо­ лее 600 мг мочевой кислоты за 24 ч) может носить

вторичный характер, т. е. быть следствием заболева­ ний, характеризующихся усилением обмена в тканях (например, рак или псориаз).

у ряда пациентов идентифицированы дефекты

ферментных систем, например ФРПФ-синтетазы

(устойчивость к ингибированию конечными продук­

тами и повышенная активность), гипоксантин­ гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ) (уме­ ньшение количества фермента или его полное отсут­

ствие, синдром Леша-НаЙхана). К этой же катего­

рии можно отнести недостаточность глюкозо-

6-фосфатазы (синдром Гирке). Имеется также груп­

па больных с идиопатической гиперурикемией, кото­

рую следует рассматривать как гетерогенную до тех

пор, пока не будет выяснена молекулярная основа

метаболических дефектов.

Синдром Леша-Найхана (полное отсутствие

ГГФРТ) наследуется как сцепленный с х­ хромосомой рецессивный признак. Болезнь характе­

ризуется корковым параличом, сопровождающимся

хореоатетозом, судорогами, стремлением к члено­

вредительству и тяжелой гиперурикемиеЙ. Кроме то­ го, наблюдается образование камней мочевой кисло­

ты. Матери больных детей гетерозиготны и мозаич­

ны в отношении ГГФРТазной недостаточности, у них часто обнаруживается гиперурикемия, но без неврологических симптомов. Частичная недостаточ­

ность ГГФРТазы, вызванная мутапиями соответ­

ствующего гена, встречается и у мужчин. Для таких

больных характерна тяжелая гиперурикемия, не со­

провождающаяся существенными неврологически­

ми нарушениями.

Избыточное образование пуринов у пациентов

с недостаточностью ГГФРТ связано с увеличенной внутриклеточной концентрацией ФРПФ, что по­

видимому является результатом уменьшения потре­

бления ФРПФ на пути регенерации пуриновых ну­

клеотидов. Биохимическая основа неврологических

отклонений при синдроме Леша-Найхана неизвест­

на.

Избыточное образование пуринов и гиперурике­

мия при болезни Гирке- явление вторичное. Оно

обусловлено повышением активности гексозомоно­

фосфатного шунта и увеличением образования рибо­

зо-5-фосфата, из которого синтезируется ФРПФ.

ДЛЯ больных с недостаточностью глюкозо-

6-фосфатазы характерен хронический молочноки­

слый аиидоз, приводящий к повышению порога се­ крепии уратов почками; это способствует накопле­

нию уратов в организме.

в плазме. Гипоурикемия у человека может быть

связана с аналогичными нарушениями.

Недостаточность ксантиноксидазы, вызванная

либо генетическим дефектом, либо тяжелым пораже­

нием печени, приводит к гипоурикемии и увеличе­

нию экскреции оксипуринов- гипоксантина и ксан­ тина. При тяжелой недостаточности ксантиноксида­

зы у пациентов часто развивается ксантинурия

иобразование ксантиновых камней.

Впоследние годы описаны два иммунодефицит­

ных заболевания, связанные с недостаточностью

ферментов метаболизма пуринов. С недостаточно­

стью аденозиндезаминазы связано тяжелое иммуно­

дефицитное заболевание, при котором снижается ко­

личество и нарушается функиия как тимусных лим­ фоцитов (Т-клеток), так и лимфоцитов костного

мозга (В-клеток). С недостаточностью пуриннуклео­ зид-фосфорилазы связана более легкая форма имму­

нодефицита, при которой функции В-лимфоцитов остаются нормальными. но сильно нарушены функ­ ции Т-лимфоцитов. Оба заболевания наследуются

по аутосомно-репессивному типу. Метаболические нарушения при рассмотренных иммунных дJlСфУНК­

циях связаны с накоплением дезоксирибонуклеотид­ трифосфатов (dGTP и dAТР), которые аллостериче­

ски ингибируют рибонуклеотидредуктазу, что,

всвою очередь, приводит к снижению содержания

вТ-лимфоцитах пула предшественников синтеза

ДНК, главным образом dCTP. Пуринодефицитные

состояния у человека встречаются редко. Часто они

бывают связаны с недостатком фолиевой кислоты и. вероятно, витамина В 12' что приводит К снижению

синтеза производных фолата.

Все известные дефекты ферментных систем (за исключением глюкозо-6-фосфатазной недостаточно­

сти, для которой соответствующих данных не полу­

чено) приводят к повышению внутриклеточной кон­

центрапии ФРПФ; избыточная продукция пуринов

при глюкозо-6-фосфатазной недостаточности, веро­

ятно, также обусловлена этим обстоятельством. Вполне возможно, что и другие нарушения обмена

пуринов, приводящие к гиперурикемии, в конечном

счете связаны с повышением внутриклеточного

уровня ФРПФ.

Другие нарушения метаболизма пуринов

Гиnоурикемия обусловлена либо усилением экскрепии, либо снижением скорости образования уратов. Известно, что доги-далматинцы, хотя

и обладают, как и другие породы собак. уриказной

активностью, не способны эффективно реадсорбhРО­ вать из клубочкового фильтрата мочевую кислоту.

В связи с этим они экскретируют ураты и мочевую

кислоту в количестве, которое является неадекватно

большим по отношению к содержанию уратов

ЗАБОЛЕВАНИЯ, СВЯЗАННЫЕ

С НАРУШЕНИЕМ МЕТАБОЛИЗМА

ПИРИМИДИНОВ (ТАБЛ. 35.3)

Как отмечалось выше, конечными продуктами

метаболизма пуринов являются хорошо раствори­

мые в воде соединения, такие, как СО2, аммиак, (3-

аланин и пропионат. Вот почему при состояниях, ха­

рактеризующихся избыточным образованием пири­

мидинов, клинические симптомы слабо выражены.

В случаях гиперурикемии, обусловленной избыточ­

ной продукцией ФРПФ, наблюдаются повышенный

синтез пиримидиновых нуклеотидов и соответствен­

но увеличенная экскреция конечных продуктов мета­

болизма, в частности (3-аланина. Поскольку для син­

теза тимидилата необходим N5, NIO-мети-

лентетрагидрофолат. нарушения метаболизма фо­

лата и витамина BI2 приводят к дефициту ТМР (вли­

яние недостатка витамина BI2 реализуется опосре­

Дованно).

Экскреция с мочой (3-аминоизобутирата- ауто­

сомный рецессивный признак. Он распространен

главным образом среди жителей Востока. Это нару-

Организм пациентов с этим типом оротовой ациду­

рии можно считать ауксотрофным по пиримидину.

Заболевание легко поддается лечению уридином. В детском возрасте для больных характерны отста­

вание в развитии, мегалобластическая анемия и «оранжевая кристаллоурия» (оротовая кислота).

При отсутствии лечения пиримидиновыми нуклеози­ дами пациенты подвержены инфекциям. Второй тип

наследуемой оротовой ацидурии (тип 11) связан с не­ достатком только ОМР-декарбоксилазы (рис. 35.19).

У пациентов, страдающих оротовой ацидурией пер­

вого типа, основным продуктом экскреции является

оротовая кислота. При обследовании больного аци­

дурией второго типа оказалось, что у него экскрети­

руется главным образом оротидин и лишь неболь­ шое количество оротовой кислоты. В эритроцитах пациентов соротовой ацидурией типа 1 были значи­

тельно повышены удельные активности аспартат­

транскарбамоилазы и дигидрооротазы; они, однако,

возвратились к норме при пероральном приеме па­

циентами уридина. Эти наблюдения свидетель­ ствуют о том, что конечные продукты пути биосин­

теза пиримидинов регулируют активность рассма­

триваемых ферментов. В условиях недостатка конеч­

ных продуктов происходит дерепрессия, вероятно,

у больных с недостаточностью орнитинтранс­ карбамоилазы - митохондриального фермента

клеток печени, ответственного за раннюю стадию

синтеза мочевины и аргинина, наблюдается увеличе­ ние экскреции оротовой кислоты, урацила и уриди­

на. По-видимому, в митохондриях этих пациентов

в результате снижения активности орнитинтранскар­

бамоилазы накапливается карбамоилфосфат. Мито­ хондриальный карбамоилфосфат диффундирует

в цитозоль, где используется как субстрат для синте­

за пиримидиновых нуклеотидов de novo. При избы­

точном образовании оротовой кислоты диагности­

руется оротовая ацидурия. Обычно она проявляется

в легкой форме и не сопровождается образованием

кристаллов. Синтез и экскреция оротовой кислоты

у таких больных усиливаются при употреблении в пищу продуктов богатых азотом, таких, как мясо.

Оротовую ацидурию могут вызывать по крайней

мере два лекарственных препарата. Аллопуринол (4-гидроксипиразолопиримидин) - пуриновый ана­ лог, инrибирующий ксантиноксидазу. Этот препарат

широко используется для лечения некоторых форм

подагры. Аллопуринол может фосфорибозилиро­

ваться оротат-фосфорибозилтрансферазой, конку­ рентно ингибируя фосфорибозилирование оротовой

ЛИТЕРАТУРА

Ames В. N. et а/. Uric acid provides ап antioxidant defense in humans against oxidantand radical-caused aging and сап­ cer: А hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 6858.

Henderson J. F. Regulation ofPurine Biosynthesis, Monograph, No. 170, American Chemical Society, 1972.

Henderson J. F., Paterson А. R. Р. Nucleotide Metabolism: Ап

Introduction, Academic Press, 1973.

Jones М. Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animal celJs, Аппи. Rev. Biochem., 1980, 49. 253.

Кеmре Т. D. et а/. StabIe mutants ofmammalian cells that over-

produce the first three enzymes of pyrimidine nucleotide biosynthesis, СеН, 1976, 9, 541.

Мartin D. W. Jr., Gelfand Е. W. Biochemistry of diseases of immunodevelopment, Аппи. Rev. Biochem., 1981, 50, 845.

Smith L. Н. Jr. Pyrimidine metabolism in тап, N. Engl. J. Med., 1973, 288, 764.

Stanbury J. В. et а/. (eds.) ТЬе Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed., McGraw-НilI, 1983.

The/ander L., Reichard Р. Reduction of ribonucleotides. Аппи. Rev. Biochem., 1979, 48, 133.

Wyngaarden J. В., Kelley W. N. Gout and Hyperuricemia, Gru- пе and Stratton, 1976.

лоэффективными. Иовая технология позволяет ад­ ресоваться за нужной информацией непосредственно

к молекуле ДИК. В настоящей главе рассмотрены

основные концепции, на которых базируется техно­ логия рекомбинантных ДИК, ее применение в кли­

нической медицине. В конце главы помещен краткий

словарь-справочник.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Разобраться в сути технологии рекомбинантных

ДИК важно по нескольким причинам.

1. Информационный взрыв в данной области

поистине головокружителен. Для того чтобы сле­

дить за исследованиями в этом направлении, необ­ ходимо усвоить фундаментальные основы генной

инженерии.

2. В настоящее время разработана стратегия изу­

чения молекулярной природы ряда заболеваний, та­

ких, как наследственная гиперхолестеролемия, муко­

висцидоз, талассемия, хорея Гентингтона, серповид­

ноклеточная анемия.

3. С помощью методов генной инженерии можно получать белки человека в количествах достаточных

для терапевтических целей (инсулин, гормон роста,

активатор плазминогена).

4. Генная инженерия открыла новые возможно­

сти получения белковых вакцин (белки вируса гепа­

тита В) и белковых препаратов для диагностических

целей (СПИД и др.).

5. Технология рекомбинантных ДИК оказалась эффективной для решения диагностических задач

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ДНК

Структура ДИК

ДИК представляет собой биополимер сложной

структуры, организованный в двойную спираль. Ее основными элементами являются пуриновые (аде­

нин и гуанин) и пиримидиновые (тимин и цитозин) основания. Эти основания присоединены к атому

С-l' углевода (дезоксирибозы). Сами углеводные

остатки соединены между собой по 3'- и 5'-

положениям фосфодиэфирными связями (рис. 37.1). Чередующиеся остатки дезоксирибозы и фосфатные группы образуют остов двойной спирали (рис. 37.2). Направление связей 3' -+ 5' определяет ориентацию

данной цепи, и, поскольку ориентации двух компле­

ментарных цепей противоположны, их называют ан­

типараллельными.

Принцип комплементарных взаимодействий пар оснований (принциn спаривания оснований) лежит

воснове построения и функционирования молекул ДИК. Аденин всегда образует пару с тимином, а гуа­ нин с цитозином. Эти пары оснований называются

комплементарными. Содержание остатков гуанина

влюбом фрагменте ДИК всегда в точности соответ­

ствует содержанmo цитозина. Так же равны друг другу количества аденина и тимина. Две цепи ДИК

удерживаются друг возле друга за счет комплемен­

тарных взаимодействий пар оснований и гидрофоб­ ных «стэкинг»-взаимодеЙствиЙ. Эти взаимодействия могут быть нарушены при нагревании, приводящем

к денатурации (плавлению) ДНК. Законы образова­

ния пар предсказывают, что при ренатурации две

комплементарные цепи ДНК должны вновь соеди­ ниться с образованием исходной структуры. Это

и происходит в действительности при медленном

остывании (отжиге) раствора ДНК, подвергнутой

тепловой денатурации.

По температуре денатураuии-ренатурации мо­

жно оценить степень комплементарности нуклеино­

вых оснований в цепях ДНК. Для денатураuии се­ гментов ДНК, характеризующихся высоким уров­ нем комплементарности. требуются соответственно

большие затраты энергии. Расхождение цепей таких фрагментов ДНК происходит соответственно при более высокой температуре. Это физическое явление

используется на практике для определения степени

сродства (гомологии) различных нуклеиновых ки­ слот и лежит в основе метода гибридизации (одного из главных в генной инженерии).

Гаплоидный набор человека состоит примерно из 3·109 пар нуклеотидов (п. н.). Если размер гена в среднем равен 3000 п. н., то, допустив, что гены не

перекрываются, а транскрипция идет лишь в одном

направлении, можно вычислить, что геном человека

включает до 10 б различных генов. Считается, что их

в геноме человека не более 1О 5 И лишь 10% геном­ ной ДНК непосредственно кодируют белки. О функ­ uиональном значении остальных 900/0 известно край­

не мало.

Двойная спираль упакована в компактную струк­ туру, образованную за счет взаимодействий с целым

рядом белков (главным образом основного характе­

ра). называемых гистонами. Такая компактизация может выполнять регуляторные функции и имеет также определенный «практический смысл». Дело в том, что ДНК ядра клетки при полном расплета­ нии достигает длины 1 м. Хромосомные белки упа­ ковывают гигантскую молекулу в ядро объемом все­ го лишь в несколько кубических микрон.

Организации гена

Как правило, прокариотические гены состоят из небольшого регуляторного участка (100-500 п. н.) и большого кодирующего белок сегмента (50010000 п. н.). Часто несколько генов контролируются

одним и тем же регуляторным элементом. Большин­

ство генов млекопитающих имеют более сложную структуру. Кодирующие области эукариотических

генов прерываются и чередуются снекодирующими

участками. Эти участки, будучи транскрибирован­

ными, удаляются в процессе созревания первичного

транскрипта. Кодирующие области (остающиеся

в зрелой мРНК) называются экзонами. Нуклеотид­ ные последовательности ДНК, находящиеся между

экзонами, называются интронами (рис. 36.1). Интро­

ны удаляются из первичного транскрипта до того,

как происходит перенос РНК в цитоплазму. Процесс удаления интронов и сшивания (лигирования) знача­

щих участков получил название «сплаЙСИНI РНК)). Неправильный сплайсинг может стать причиной бо­

лезни человека (см. ниже), что указывает на важ­ ность этой посттранскрипционной стадии. Регуля­ торные области эукариотических генов обычно ра­ сполагаются с 5'-конца от точки инициации тра­ скрипции (5'-фланкирующая IlOследовательность ДНК). Иногда регуляторные последовательности находятся внутри самого гена или даже в 3'- фланкирующей области. В клетках млекопитающих каждый ген обладает собственным регу­ ляторным элементом. Многие гены эукариот (а

также некоторых вирусов, реплицирующихся в

клетках млекопитающих) содержат специальные участки ДНК, называемые «энхансерамю>, которые повышают уровень транскрипuии. Некоторые гены содержат также «сайленсеры»- участки, ослаб­ ляющие транскрипцию. Гены млекопитающих -

это сложные, многокомпонентные структуры.

Транскрипция генов

Основное направление передачи генетичес­

Процесс этот жестко контролируется и состоит из

ряда сложных этапов, каждый из которых регули­

руется одним или несколькими ферментами или фак­

торами. Ошибка на любом этапе может приводить к заболеванию.

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

в основе методологии генной инженерии лежит

выделение ДНК и проведение различных манипуля­

ций с ее молекулами, включая получение химер (на­

пример, молекулы ДНК, построенной из фрагмен­

тов ДНК человека и бактерий).

Ферменты рестрикции

Один из важнейших инструментов генной инже­ нерии - эндонуклеазы, ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим последовательностям ну­

клеотидов внутри цепи (в противоположность экзо­ нуклеазам, которые расщепляют ДНК с концов мо­

лекулы). Эти ферменты получили название рестрик­

таз, поскольку их присутствие в бактериальной клет­ ке ограничивает рост определенных бактериальных

вирусов, называемых бактериофагами. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фраг­

менты в участках последовательности строго опре­

деленной структуры. Этим их воздействие отличает­ ся от большинства других ферментативных, химиче-

!

ВamHI GGATCC CCTAGG

f

!

ВgIII AGATCT TCTAGA

f

!

EcoRI GAATTC CTTAAG

t

!

EcoRl1 CCTGG GGACC

f

!

Hindlll AAGCTT TTCGAA

f

!

Hhal GCGC CGCG

f

!

Hpal GTTAAC CAATTG

f

!

Mstll CCTNAGG GGANTCC

f

!

Pstl CTGCAG GACGTC

f

!

Taql TCGA

AGCT

t

8acillus аmу/оПquеfасiеns

8acillus g/obigii

Escherichia соП АУ13

Escherichia соП А245

" R

HiJemophilus influenzae d

Haemophilus haemo/yticus

Haemophi/us parainfluenzae

Microco/eus strain

Providencia stuartii 164

Thermus aquaticus VTI

ваний (46). Любой фрагмент ДИК обладает харак­

терным расположением сайтов узнавания различных

рестриктаз, что позволяет строить так называемые

рестриктазные карты. При расщеплении ДИК какой­

либо одной рестриктазой получают смесь фрагмен­

тов, каждый из которых имеет одни и те же концевые

участки. Такие фрагменты можно разделить мето­

дом электрофореза в агарозном или полиакрил­ амидном геле (о методах блоттинга см. ниже). Эта

процедура, основанная на применении рестриктаз,

представляет собой важнейший этап клонирования

генов.

Другие ферменты

Ряд других ферментов, использующих ДИК в ка­

честве субстрата, также имеет важное значение для генной инженерии. Иа некоторых из них мы остано­

вимся в этой и последующих главах (табл. 36.2).

Конструирование химерных молекул ДИК

Ковалентное соединение (в дальнейшем мы бу­

дем ПОЛЬЗОJJаться термином «лигирование») липких

концов фрагментов ДИК-процедура технически не