3.51. Как выполняются одношаговые исследования

АКТИВНОСТИ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ?

Определение активности отдельных факторов свертывания неотделимо от решения большого количества гемостазиологических проблем, в осо­бенности в области диагностики наследственных нарушений гемостаза, ди­агностики и мониторинга приобретенных нарушений свертывания, монито­ринга заместительной терапии прокоагулянтными фракциями плазмы, а также для определения активности этих фракций при их приготовлении. Во всех этих случаях целью исследования является определение уровня сни­жения активности фактора. Однако, в настоящее время наблюдается рас­тущий интерес к определению увеличения активности фактора для оценки состояния гиперкоагуляции.

Процедура исследования

В одношаговом тестировании в одной и той же реакционной смеси проис­ходят активация факторов и образование фибрина. Для выполнения такого теста нужно иметь следующее:

• фактор-дефицитную плазму (субстратная плазма)

• исследуемый образец, контрольная или референсная плазма

• активирующий агент

• стартовый реагент.

Фактор-дефицитная плазма - это плазма, в которой отсутствует определя­емый фактор, а остальные содержатся в нормальном количестве, включая фибриноген.

В качестве тестируемого материала используется цитратная бестромбоцитная плазма. Исследования факторов выполняются только с цитратной плазмой, разведенной буферным раствором, так как в неразведенной или не­правильно разведенной плазме разница в клоттинговом времени между от­дельными шагами разведения не существует или пренебрежимо мала.

В зависимости от тестируемого фактора, исследования активности прово­дятся или с активацией внутреннего пути свертывания (АПТВ), или внешнего пути свертывания (ПВ). Исследования активности VIII, IX, XI, XII факторов про­водятся с активацией внутреннего пути (реакция АПТВ), VII фактор - с актива­цией внешнего пути (прот­ром­биновое время). II, V, Х факторы можно опреде­лять любым из этих способов.

В качестве стартового реагента используется раствор хлорида кальция. Время между добавлением стартового реагента и образованием фибрина яв­ляется основой для расчета активности соотвествующего фактора.

Калибровочная кривая

При построении калибровочной кривой на ее линейном участке должно находиться несколько точек серийного разведения нормальной плазмы или калибратора. Для получения линейной кривой график обычно строится либо в полулогарифмическом, либо в логарифмическом масштабе. Начальной точ­кой должно являться 100% значение (разведение 1/1), а дальше помещают­ся точки серийных разведении 1/5, 1/10, 1/20. На линейной части калибро­вочной кривой должно находиться также значение 1% активности.

Калибровочная кривая для определения активности II Фактора.

• Определение с использованием АПТВ реакции

о Определение с использованием протромбинового времени

3.52. Что подразумевается под "остаточной активностью"?

В большинстве производимых в настоящее время тест-систем для опреде­ления свертывающей активности образование фибрина происходит после рекальцификации даже без добавления разведения тестируемой плазмы. Это собственное свертывание тест-системы, также известное как остаточная ак­тивность, вызвано тем, что в дефицитной плазме тем не менее присутствуют минимальные количества фактора. Собственное свертывание - это время на­чала сгусткообразования, когда вместо тестируемого образца в дефицитную плазму добавляется буфер. Количественное значение собственной активно­сти тест-системы рассчитывается экстраполяцией из калибровочной кривой. Невозможно определить остаточную активность дефицитной плазмы, исполь­зуя другую дефицитную плазму, так как на результат в этом случае влияет ос­таточная активность последней.

Дефицитная по VIII фактору плазма. Калибровочная кривая и собственная активносгь тест-системы (остаточная активность)

РИСУНОК

Остаточная активность, получаемая методом экстраполяции, имеет крити ческое значение для результатов активности фактора, определяемого с помо­щью данной тест-системы, и может являться причиной расхождения данных активности фактора у одного и того же пациента.

Активность VIII фактора для четырех больных гемофилией А, определенная с помощью двух тест-систем с разной остаточной активностью (А и В)

Тест-система	Остаточная активность, %%	Активность VIII фактора пациента, %%
		1	2	3	4
А	0,19	0,3	0,9	4,7	10
В	1,9	2,4	5,2	13	22