1. (Ифа) Иммунноферментный

анализ

2. Полимеразная цепная реакция (пцр)

3. Определение уровня сд4 лимфоцитов

Чувствительность данных

методов превышает 99 % !

Метод ИФА – является скрининговым

Позволяет выявлять в биологических жидкостях антитела к ВИЧ1 и ВИЧ2, а в последнее время и антиген р24.

Для подтверждения ВИЧ-инфекции используют метод Иммуноблотинга (Вестерн блот), который позволяет выявлять антитела к отдельным белкам вируса: gp41, gp120, gp160.

Метод иммунного блотинга

• Выполняется в Областном центре по профилактике СПИДа и инфекционных заболеваний;

• Данным методом обследуются пациенты дважды серопозитивные по ИФА;

• Позволяет выявлять антитела не просто к вирусу иммунодефицита человека, а к конкретным белкам вируса;

• До сих пор является арбитражным методом при диагностике ВИЧ-инфекции и СПИДА;

• Все серонегативные обследуемые по иммунному блоту, должны находиться на учете в Областном центре по профилактике СПИДа и инфекционных заболеваний в течение года.

Метод ПЦР может применяться для арбитражной диагностики ВИЧ-Инфекции, так как вирус реплицируется в течение всего периода заболевания! Преимущества:

1. Прямое выявление самого возбудителя (РНК вируса); 2. Высокая чувствительность и специфичность метода; 3. Определение возбудителя инфекции в острую и латентную стадии заболевания; 4. Выявление доноров в стадию «серонегативного окна» (длится 1-3 недели) Недостаток – возможность контаминации.

Установлено, что через несколько недель после заражения происходит массовое размножение ВИЧ, сопровождающееся гибелью СD4+ лимфоцитов, т.к. вирус иммунодефицита человека обладает тропностью к рецепторам СD4 клеток. В этот период можно наблюдать ответную реакцию организма в виде увеличения лимфатических узлов и нередко селезенки, а также в виде лихорадки. Затем появляются антитела к ВИЧ, вслед за иммунным ответом концентрация вируса в плазме снижается, а количество СD4 клеток возрастает, но прежнего уровня не достигает. Затем наступает стадия относительного равновесия между вирусной репликацией и иммунным ответом на неопределенный период времени (Gains H. et al., 1987; Lender B., 1998).

ВИЧ отличается исключительно высокой генетической изменчивостью. Исключительная вирусная изменчивость позволяет вирусу выжить в инфицированном организме, ибо всегда в огромном пуле найдется вирус, способный к эволюционному отбору.

ВИЧ-инфицирование приводит, прежде всего, к формированию неполноценности макрофагального и Т-хелперного звеньев системы иммунитета, а динамика соотношения Т-хелперов и Т-супрессоров определяет длительность латентного периода заболевания и вектор поражения органов и тканей. У 90–95% инфицированных лиц антитела к ВИЧ появляются в пределах от 3 недель до 3 месяцев, у 52,9% – в течение 6, у 0,5–1% в более поздние сроки.

Выработка антител к ВИЧ имеет фазовый характер, уровень их непостоянен и колеблется в широких пределах в зависимости от стадии и характера течения заболевания. Вируснейтрализующая активность сыворотки при ВИЧ-инфекции в целом невысока. В самом начале заболевания антитела обеспечивают иммунитет к ВИЧ, однако по мере прогрессирования болезни они все более превращаются в простых свидетелей процесса. Одна из причин данного явления заключается в чрезвычайно высокой мутабельности вируса иммунодефицита человека, что приводит к постоянному «выскальзыванию» вируса от нейтрализации антителами (Воробьев П.А. с соавт, 2006).

ВИЧ-инфекция протекает со сменой нескольких стадий: инкубационный период от 2 до 3 недель до 3 месяцев, затем у 50–90% инфицированных появляются симптомы острой ВИЧ-инфекции. Наиболее часто встречается гриппомононуклеозноподобный синдром, продолжающийся 2–3 недели, сопровождающийся лихорадкой, тонзиллитом, фарингитом, лимфоаденопатией, гепатоспленомегалией, кратковременной диареей, кожными высыпаниями; затем начинается период латентной инфекции от 1 до 8 лет (вирусоносительство). Реже предыдущая стадия начинается с прогрессирующей генерализованной лимфоаденопатии. Последняя стадия заболевания – СПИД проявляется оппортунистическими инфекциями, опухолями, энцефалитами и другими патологическими изменениями, приводящими больного к гибели. При этом единожды инфицированный человек остается источником заражения в течение всей оставшейся жизни.

ВИЧ-1 может передаваться через любые компоненты крови. К середине 1990-х годов были сведения о более чем 7500 случаях СПИД, при которых переливание крови или пересадка тканей были единственно идентифицированными факторами риска. Кроме того, 4200 случаев произошли у больных гемофилией, которые получали концентраты факторов свертывания крови. СПИД, связанный с трансфузией, включая больных гемофилией, составляет около 2,3 % всех случаев этого заболевания. Есть данные приблизительно о 30 людях, пострадавших от гемотрансфузий, полученных ими до введения обязательного обследования на наличие анти-ВИЧ в 1995 году (Покровский В.В. с соавт, 1996, 2000). Интервал между переливанием и диагностикой СПИД составлял в среднем 58 месяцев. Согласно данным, полученным некоторыми исследователями, ВИЧ-инфекция развилась у 89,5 % реципиентов, получивших кровь от анти-ВИЧ-положительных доноров. За исключением концентратов факторов свертывания крови, другие производные плазмы, такие как альбумин и иммуноглобулины, не вызывают инфицирования ВИЧ.

Основным показателем ВИЧ-инфицированности служит выявление в крови антител к наиболее распространенным 1-му и 2-му типам вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). В связи, с этим одной из наиболее эффективных мер предотвращения распространения СПИДа является контроль донорской крови на наличие вышеназванных антител методом иммуноферментного анализа с последующим подтверждением их специфичности с помощью метода иммунного блотинга. Причем чувствительность данных методов превышает 99%. Принцип метода иммунного блотинга заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса. Обнаружение антител к одному из гликопротеинов gр 41, gрI20, gp 160 следует считать положительным результатом. Такого человека следует обследовать через 3 и 6 месяцев. Отсутствие антител к белкам ВИЧ означает, что в ИФА получена ложноположительная реакция, которая может быть связана с латентной стадией заболевания, иммунологическим или физиологическим «окном» между появлением возбудителя в крови и иммунным ответом (который может составлять до нескольких месяцев). В этих случаях используется ПЦР-диагностика. Главными достоинствами ПЦР являются: прямое определение возбудителя, высокая специфичность и чувствительность (определение возбудителя по 10–100 копиям ДНК), возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций, а также может помочь в оценке прогноза течения ВИЧ - инфекции.

Появившиеся NAT-генамплификационные методы выявления возбудителей инфекционных заболеваний стали незамедлительно использоваться в лабораториях для обнаружения НСV и HIV-1 в донорской крови и ее компонентах. Несколько лет назад стало ясно, что повышение чувствительности обнаружения вируса гепатита С и ВИЧ-1 с помощью методов NАТ может обеспечить более высокий уровень безопасности национальных запасов крови и плазмы и что было бы желательно их широкое распространение в кратчайшие сроки. С 1 июля 1999 года NАТ - скринирование крови на вирус гепатита С стало обязательным в Европе для всей плазмы крови, используемой для фракционирования. Собранная в СIIIА кровь и плазма проходит скрининг на антитела и антигены НСV, ВИЧ-1 и вирус гепатита В с применением высокочувствительных методов ИФА. Такие тесты использовались в течение многих лет ещё до появления NАТ, и в целом, их применение обеспечивало высокий уровень безопасности. Однако, в ряде случаев при проведении ИФА инфицированные донации давали ложноотрицательный результат. Методом NАТ может быть выявлено и исключено из трансфузионного использования большинство инфицированных донаций. В настоящее время NАТ-скринирование в минипулах позволяет выявлять 5–6 копий вирусного генома в 1 мл пула, это равнозначно 80–7200 копий вируса в 1 мл донорской крови или плазмы. Большая часть инфицированной крови поступает от доноров в «период серологического окна», когда у инфицированного человека еще нет маркеров, детектируемых в плазме крови с помощью иммунологических методов. Развитие и внедрение NАТ для обнаружения ВИЧ-1 проходило параллельно с аналогичным процессом NАТ-скрининга на вирус гепатита С. К концу 1999 года NАТ-скринирование на ВИЧ-1 в США проводилось более чем для 99% донаций плазмы, аналогичный показатель для цельной крови был достигнут к середине 2000 года.

Во Франции при общей тенденции снижения риска посттрансфузионной передачи вирусов в период 1992-2000 гг. эффект от внедрения метода полимеразной цепной реакции оценен как двукратное снижение риска передачи ВИЧ и примерно как десятикратное снижение риска передачи вируса гепатита С. Обобщение данных по Италии позволило авторам сделать выводы о том, что период серонегативного «окна» между инфицированием и обнаружением инфекции при использовании NAT в сравнении с обычным ИФА сокращается для гепатита С с 70 дней до 12, а для ВИЧ с 22 дней до 11. Сходные данные были получены для Испании.

Концентрация РНК ВИЧ в крови является самостоятельным показателем активности инфекционного процесса, отражающим уровень репликации вируса. В отличие от остальных лабораторных маркеров ВИЧ-инфекции РНК ВИЧ, определяемая с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), обнаруживается на всех стадиях заболевания, что говорит о постоянной, непрекращающейся репликации вируса в течение всего периода заболевания.

Другим маркером наличия вируса иммунодефицита в организме человека является антиген р24, который может присутствовать в плазме инфицированных лиц в течение всех стадий заболевания, но чаще р24-антигенемия наблюдается в начале заболевания и в период развития клинически выраженного иммунодефицита (на протяжении латентной стадии инфекции антиген находится в связанном с антителами состоянии). Хотя уровень антигена р24 коррелирует с прогрессированием заболевания, методы по его определению обладают очень низкой чувствительностью. Поэтому NAT-скрининг для выявления ВИЧ-1 позволяет отменить определение его антигена р24, рекомендованная как временная мера в 1996 году.