Uchebnik

Дитерпеноидные алкалоиды с ликоктониновым углеродным скелетом считают наиболее распространенными, для них изучены наиболее устойчивые конформации всех циклов.

Рентгеноструктурным анализом структур эфедриновых, цитизиновых и анабазиновых алкалоидов установлены конформеры с линейной формой молекул эфедрина, псевдоэфедрина и их производных. Цитизиновые алкалоиды в кристаллическом состоянии имеют жесткую конформацию циклов, а молекула анабазина может иметь 8 конформационных форм, наиболее устойчивые из них имеют конформацию кресла пиперидинового цикла и экваториальную ориентацию пиридинового кольца.

Общие подходы к технологии выделения алкалоидов

Пригодным для производства препаратов считается растительное сырье с содержанием суммы алкалоидов не менее 0.35%. В качестве сырья могут быть использованы дикорастущие или специально выращиваемые на возделываемых почвах растения. Последние, как правило, содержат больше алкалоидов по сравнению с дикорастущими аналогами, поскольку при выращивании используются специальные приемы или селекционные культуры.

Главная задача получения алкалоидов - максимальная экстракция их из сырья и отделение балластных веществ. Если сырье содержит несколько алкалоидов, особенно близких по структуре, трудоемкой стадией является их разделение на индивидуальные компоненты и очистка.

Общая технологическая блок-схема выделения и очистки алкалоидов

Алкалоиды в виде основания при энергичном перемешивании экстрагируют растворителем в определенных оптимальных условиях. Если алкалоиды находятся в виде солей (чаще всего в виде гидрохлорида), то исходное сырье в экстракторах предварительно обрабатывают водными 1-5 % растворами щелочей (NаОН, КОН, Nа2СО3 или NН3). Главная цель экстракции - максимальное извлечение целевого алкалоида из сырья при минимальном содержании в экстракте сопутствующих примесей. Эффективность процесса экстракции зависит от используемого на данной стадии растворителя, а выбор последнего зависит от свойств алкалоидов, от условий и параметров процесса экстракции. В общем случае необходимы растворители, несмешивающиеся с водой и хорошо растворяющие основания алкалоидов. Наиболее широко используются такие полярные растворители, как хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан, трихлорэтилен, диэтиловый эфир, этилацетат, бутилацетат и т.п. В качестве экстракторов применяют диффузионные батареи, перколяторы и экстракторы непрерывного действия с использованием принципа противотока. В последнее время для экстракции все шире применяют роторно-пульсационные и ультразвуковые установки, которые позволяют значительно повысить эффективность и скорость экстракции, сократить расход растворителей и ценного сырья.

41

После экстракции следует отделение нерастворимых остатков сырья (шрота). Это процесс обычно проводится одновременно с экстракцией в самих экстракторах (диффузорах, в перколяторах и т.п.). Отделенный от шрота экстракт основания-алкалоида может содержать значительное количество балластных веществ и примесей различного характера, и дальнейшие операции связаны с их отделением.

Процесс отделения алкалоидов от балластных веществ опирается на основные свойства атомов азота в структуре алкалоидов, благодаря чему они способны образовывать соли в присутствии кислот, с обратным превращением в основания под воздействием щелочей.

Фармакопейный алкалоид

Типовая технология предусматривает, по крайней мере, 2 реэкстракции. Первая реэкстракция заключается в обработке экстракта - основания алкалоида 1-3% водным раствором минеральной кислоты (НСl, Н2SО4, Н3РО4) при этом образуется соль алкалоида, которая, как правило, хорошо растворима в воде и переходит из органической фазы в водный раствор. На этом этапе, с

42

органическим растворителем отделяется значительная часть балластных веществ, не содержащих основные группы и не растворимых в воде (углеводороды, терпены, липиды). Органический растворитель после отделения водного слоя направляется на переработку и повторное использование.

Разделение водной и органической фаз, при значительных объемах производства, осуществляется в непрерывнодействующих отстойных центрифугах или в сепараторах. Далее водный слой поступает на вторую реэкстракцию, цель которой - отделение водорастворимых примесей (углеводы, полисахариды, некоторые аминокислоты и пептиды). Для этого водный раствор соли алкалоида подщелачивают растворами NаОН или NН3 до рН не менее 8, при этом соль превращается в основание алкалоида, которое вновь экстрагируется органическим растворителем, не смешивающимся с водой. Экстракт основания-алкалоида отделяют от водного слоя с водорастворимыми примесями и тщательно промывают водой до нейтральной реакции промывных вод.

Выделение алкалоидов из экстракта может осуществляться двумя методами. Для получения оснований алкалоидов экстракт концентрируют в вакууме при температуре 40-600С до начала кристаллизации основания, после охлаждения кубового остатка в кристаллизаторе технический продукт отфильтровывают и направляют на стадию очистки. По другому варианту алкалоид выделяют из экстракта в виде соли, чаще всего в виде гидрохлорида. Для этого экстракт обычно насыщают сухим газообразным хлористым водородом, выделившийся из органического растворителя гидрохлорид алкалоида отделяют фильтрованием и также направляют на дополнительную очистку.

Для получения чистого продукта используются либо многократные повторяющиеся операции очистки, либо сочетание различных способов очистки. Хорошо кристаллизующиеся алкалоиды (основания или соли) могут быть очищены трех-четырехкратной перекристаллизацией из воды или органического растворителя с применением осветляющих абсорбентов (активированный уголь, прокаленный оксид алюминия, пористые силикаты и т.п.).

Однако в ряде случаев, когда алкалоид содержит в качестве примесей близкие по строению и свойствам другие алкалоиды, перекристаллизация или переосаждение могут оказаться не эффективными для разделения таких смесей. В этих случаях для предварительной очистки применяют ионообменные смолы, обычно катионит (КУ или КБ). Смолу с сорбированным алкалоидом тщательно промывают водой или органическими растворителями и затем проводят фракционную десорбцию смеси алкалоидов. Используя различную основность целевого продукта и примесей, удается разделить смесь даже нескольких близких по строению алкалоидов.

При извлечении алкалоидов в виде оснований, сильные щелочи (NаОН, КОН) используют для выделения сильных оснований-алкалоидов и алкалоидов, связанных с дубильными веществами (кора хинного и гранатового дерева), но не применяют для выделения алкалоидов, в структуре которых имеются фенольные ОН-группы. Например, морфин, сальсолин, некоторые

43

эргоалкалоиды образуют феноляты и, вследствие этого, не извлекаются органическими растворителями, но хорошо растворимы в воде.

При выделении алкалоидов, имеющих в структуре сложноэфирные группы (атропин гиосциамин, скополамин и др.) используют аммиак или слабые основания, так как сильные щелочи могут вызывать разложение таких алкалоидов по сложноэфирной связи.

Нельзя использовать NаОН при выделении алкалоидов из семян, т.к. при этом происходит омыление масел и образование мыл, вызывающих образование эмульсий.

При использовании карбонатов следует полностью удалять углекислоту, которая может способствовать солеобразованию и снижению выхода алкалоидов-оснований.

Доочистка и разделение алкалоидов чаще проводятся с использованием метода адсорбционной хроматографии по двум направлениям:

адсорбируются сопутствующие вещества, алкалоиды остаются в растворе;

адсорбируются алкалоиды, сопутствующие вещества остаются в растворе, отсюда следует выбор сорбента, параметры колонки, подбор элюентов и рН процессов.

Так как большинство алкалоидов отличается физическими и химическими свойствами, предложить одну, универсальную схему их выделения и разделения не удается, однако можно в каждом конкретном случае использовать специфику состава сырья и специфические свойства отдельных групп алкалоидов.

Для разделения суммы алкалоидов можно использовать различия в растворимости отдельных алкалоидов в разных органических растворителях, различную степень основности (более слабые основания-алкалоиды будут в первых фракциях элюентов), возможность получения солей или производных, различия в температурах кипения, в адсорбционной способности и т.д.

Ниже представлена схема разделения основных алкалоидов опийного экстракта:

44

Качественное определение и идентификация алкалоидов

Для обнаружения алкалоидов чаще всего используют осадочные и цветные реакции и методы хроматографии. Так, реакции осаждения позволяют установить наличие алкалоидов даже при незначительном их содержании (соли тяжелых металлов, комплексные иодиды и кислоты, специфические реакции). Если реакция положительная, выпадают аморфные или кристаллические осадки.

Для проведения цветных реакций готовят извлечения из сырья или препарата. Цветные реакции на алкалоиды классифицируют в зависимости от реагентов: 1) с использованием дегидратирующих агентов (например, серной кислоты, хлористого цинка); 2) с окисляющими агентами (азотной кислотой, смесью серной кислоты и перекиси водорода, двуокисью марганца, бихроматом калия, молибденовой и ванадиевой кислотами); 3) со специальными реагентами (например, с хлорным железом для индольного ядра). Следует отметить, что большинство алкалоидов нельзя сколько-нибудь уверенно определить только по цветным реакциям.

Добавляют 1-3 мл реактива Бушарда, Вагнера, Люголя (раствор 1.27 г

йода в 100 мл раствора 2 г иодида калия в воде), появляется бурый осадок или окрашивание. Большинство гидрохлоридов алкалоидов определяются из разбавленных растворов.

Добавляют 2-3 мл реактива Майера (1.358 г ртути хлорида растворяют

в60 мл воды, добавляют раствор 5 г калия иодида в 10 мл воды и доводят объем раствора до 100 мл водой), подкисляют до нейтральной или слабо кислой среды, выпадают осадки белого или светло-желтого цвета (все алкалоиды, кроме кофеина и колхицина). Реакция очень чувствительна для кислых растворов алкалоидов. Полученные осадки растворимы в спирте, уксусной кислоте и избытке реагента.

Добавляют 1-5 мл реактива Драгендорфа (раствор 0.85 г висмута иодида или нитрата основного в 40 мл воды, 10 мл кислоты уксусной (раствор 1). 2 г калия иодида растворяют в 50 мл воды очищенной (раствор 2). Смешивают равные объемы растворов 1 и 2, отбирают 10 мл полученной смеси, добавляют 100 мл воды очищенной и 20 мл кислоты уксусной ледяной, взбалтывают 15 минут), выпадают осадки оранжевого, красного или кирпичного цвета (кислые растворы солей алкалоидов), оранжевое окрашивание (стероидные алкалоиды).

Добавляют 1-3 мл реактива Зонненштейна (1% раствор кислоты

фосфорномолибденовой /Н7Р(Мо2О7)·Н2О/), выпадают осадки белого, желтого или оранжевого цвета, которые при стоянии приобретают синие или зеленые оттенки вследствие восстановления молибденовой кислоты до оксида молибдена.

Добавляют 1-3 мл реактива Шейблера (1% раствор кислоты фосфорно-

вольфрамовой /Р2О5·12WO3·42Н2О/), появляется осадок разноокрашенный,

чаще белого цвета (особенно чувствительна для хинина и стрихнина).

46

Добавляют 1-2 мл 1% водного раствора кислоты пикриновой (2,4,6- тринитрофенол), появляется окрашивание или выпадают осадки солей желтого цвета (все алкалоиды, кроме кофеина, морфина, аконитина, теобромина);

атропин и морфин осаждается из концентрированных и нейтральных растворов кислоты. Насыщенный водный раствор пикриновой кислоты - реактив Хагера лучше добавлять к подкисленному раствору алкалоидов.

Добавляют 10 капель кислоты хлороводородной разведенной и 10 капель пергидроля, выпаривают на водяной бане досуха. К остатку добавляют 1-2 капли раствора аммиака, появляется пурпурно-красное окрашивание

(кофеин).

Добавляют 1-3 мл реактива Бертрана (1% раствор кремневольфра-

мовой кислоты) /SiO2·12WO3·2Н2О/, появляется белый осадок (разные типы алкалоидов).

Реакция Витали-Морена. Добавляют 1-3 мл кислоты азотной концентрированной, выпаривают на водяной бане, появляется желтое окрашивание и осадок. При добавлении к осадку 1-3 мл 5% раствора натрия гидроксида спиртового появляется фиолетовое окрашивание или осадок (производные троповой кислоты. Кокаин этой реакции не дает!).

Добавляют 2-3 мл реактива Марме (раствор 10 г иодида кадмия в 100

мл 20% водного раствора калия иодида) /К2[СdI4]/, появляется белый или желтый осадок при стоянии постепенно растворимый в избытке реактива (все алкалоиды, кроме кофеина, атропина, колхицина, вератрина). Осаждать лучше из слабокислого раствора.

Добавляют 1 мл бромной воды, появляется желтое окрашивание

(сальсолидин), оранжевое (термопсин), ярко-красное (сальсолин); добавляют 1

мл бромной воды и 1н раствора аммиака концентрированного, появляется зеленое окрашивание (хининовые, хинолиновые алкалоиды, пахикарпин).

Добавляют 2-3 капли кислоты серной разведенной, появляется голубая флюоресценция (хинин).

Добавляют 1-2 капли 1% раствора калия перманганата, выпадает фиолетовый осадок (кокаин).

Добавляют 1-2 капли 3% раствора хлорида железа окисного, нагревают 1-3 минуты, появляется зеленое, затем фиолетово-синее окрашивание. При добавлении 1 капли разбавленной кислоты азотной появляется красное окрашивание (морфиновые алкалоиды). При добавлении 1 капли кислоты азотной концентрированной появляется кроваво-красное окрашивание

(апоморфин).

47

Добавляют 1 мл кислоты азотной концентрированной, нагревают 1-2 минуты; добавляют 1 каплю 0.5н раствора калия гидроксида и 1 мл ацетона, появляется фиолетовое окрашивание, исчезающее при стоянии (атропиновые,

хининовые алкалоиды).

Реакция Брэди. Добавляют 1-2 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина

вкислоте хлороводородной, выпадает осадок желтого цвета (дигидрокодеинон в отличие от морфина, тебаина, кофеина).

Реакция Фреде. Добавляют несколько капель 5% раствора аммония молибдата в кислоте серной концентрированной, появляется фиолетовое окрашивание, переходящее в синее, а при стоянии в зеленое (морфин).

Реакция Альберта. Добавляют несколько капель 40% раствора формальдегида в кислоте серной или уксусной концентрированной, появляется

малиновое или малиново-красное окрашивание (морфин - пурпурное фиолетовое; кодеин - сине-фиолетовое; малиново-красное – гликоалкалоиды, зеленое сине-зеленое сиреневое вишневое - глауцин).

Добавляют 1-3 мл насыщенного раствора сурьмы треххлористой в хлороформе, нагревают, появляется кирпично-красное окрашивание

(стероидные алкалоиды, стероидные амины).

Добавляют несколько капель раствора меди сульфата и несколько капель раствора натрия гидроксида, появляется синее окрашивание или осадок. Взбалтывают его с 1 мл эфира. Эфирный слой окрашивается в фиолетовокрасный цвет, водный слой остается синим (эфедрин, алкалоиды со вторичной аминогруппой).

Добавляют 2-3 мл 1% раствора кислоты винной и 1 мл раствора п- диметиламинобензальдегида, появляется сине-фиолетовое окрашивание

(алкалоиды спорыньи).

Реакция Эрлиха: добавляют 1-2 капли 1% п-диметиламинобенз-

альдегида в смеси (25% кислота хлороводородная, этанол безводный 1:1),

нагревают до 700С (УФ 254 и 336 нм) (эргокристин, дигидроэргокристин).

Добавляют 1-3 мл 4% раствора кислоты винной в 50% растворе метанола, нагревают 3 минуты с перемешиванием, охлаждают, добавляют 2-3 мл реактива ван-Урка (к 35 мл воды приливают при перемешивании 65 мл

кислоты серной концентрированной и 0.03 мл 10% раствора хлорида железа окисного. Охлаждают до 500С, добавляют 0.2 г п-диметиламинобензальдегида. Реактив используют после стояния в течение 24 часов), появляется синефиолетовое окрашивание (алкалоиды спорыньи).

Добавляют 1 мл 5% раствора натрия ацетата, выпадает белый хлопьевидный осадок (наркотин, папаверин). Осадок на часовом стекле смешивают с несколькими кристаллами персульфата калия или аммония и 2 каплями кислоты серной концентрированной, появляется интенсивное красно-бурое окрашивание (наркотин). К фильтрату после отделения осадка добавляют несколько капель 5% раствора натрия гидроксида и 3 мл эфира. Эфирное извлечение испаряют на часовом стекле досуха и к остатку добавляют 2 капли смеси из 1.5 мл формалина и 8.5 мл кислоты серной концентрированной, появляется фиолетовое окрашивание (кодеин).

48

Добавляют 1-2 капли кислоты серной концентрированной, появляется оранжевое окрашивание, быстро переходящее при стоянии в желтое (отличие кодеина от морфина).

Добавляют 1-2 капли кислоты хлороводородной и 2 капли 10% водноспиртового раствора танина, появляются белые или желтоватые аморфные осадки (все типы алкалоидов). От добавления 1-3 мл 0.1% раствора танина появляется белый осадок растворимый в избытке реактива (кофеин).

Добавляют 1-2 капли кислоты серной концентрированной. 1 каплю 3% раствора, хлорида железа окисного, нагревают 1-2 минуты, появляется синее окрашивание переходящее в красное при добавлении 1 капли кислоты азотной разведенной (кодеиновые алкалоиды).

Добавляют 1-2 капли 1% раствора кислоты пикролоновой (1-п-нитро- фенил-3-метил-4-нитропиразолон-5), появляется ярко-желтое окрашивание, при стоянии выпадают осадки (алкалоиды, имеющие в структуре вторичный и третичный азот).

Добавляют 1 мл 5% раствора натрия нитропруссида и 1 мл 5% натрия гидроксида появляется вишневое окрашивание (пахикарпин). При добавлении 1 мл кислоты хлороводородной концентрированной сохраняется вишневое окрашивание (пилокарпин, сферофизин).

Добавляют 1 мл 5% раствора кобальта нитрата, появляется голубоватое окрашивание, затем зеленый осадок (цитизин).

Добавляют 1-2 капли 5% раствора кислоты стифниновой (1,3-диокси- 2,4,6-тринитробензол), выпадает осадок желтого цвета (все алкалоиды).

Добавляют 3 мл реактива Эрдмана (концентрированные серная и азотная кислоты 1:1), появляется различное, чаще желтое окрашивание

(алкалоиды-основания).

Добавляют 1-3 кристалла гидроксиламина («гидроксамовая проба», появляется окрашивание, добавляют 1-2 мл 3% раствора железа окисного хлорида, окраска меняется до красно-фиолетовой (платифиллин, сложные эфиры).

5 мл эфирного извлечения помещают в фарфоровую чашку и осторожно выпаривают. Остаток в чашке смачивают 1 мл кислоты азотной концентрированной и выпаривают на водяной бане досуха. К остатку добавляют несколько капель 0.5М спиртового раствора калия гидроксида и ацетона, появляется фиолетовое окрашивание, исчезающее при стоянии (алкалоиды).

5 мл эфирного извлечения осторожно выпаривают в фарфоровой чашке на водяной бане досуха. Остаток растворяют в 2 мл ацетона, добавляют 5 капель кислоты хлороводородной концентрированной и 0.1 г ванадата аммония, появляется зеленое окрашивание (капсаицин):

49

Хроматографический анализ:

Помимо качественных реакций на различные группы алкалоидов, для обнаружения и идентификации, разделения и контроля степени очистки используют методы бумажной (БХ), тонкослойной (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ) или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Для бумажной хроматографии используют системы: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), (10:2:3), (40:12.5:29); н-бутанол - соляная кислота - вода (100:4:до насыщения) с последующей обработкой сухих хроматограмм реактивом Драгендорфа (оранжевые, оранжево-красные пятна на желтом фоне), в парах йода - бурые пятна.

Стероидные алкалоиды идентифицируют по кирпично-красному окрашиванию от действия треххлористой сурьмы в хлороформе.

ТСХ на пластинках алюминия оксида может быть использована для качественного и количественного анализа, для разделения алкалоидов различной основности и пространственного строения.

Возможно использование силикагеля КСК и кремниевой кислоты (для хроматографии).

Для любых сорбентов пригодны системы: хлороформ - метиловый спирт - уксусная кислота (18:1:1), (10:3:3); хлороформ - этиловый спирт (9:1), (8:2);

ацетон - аммиак (95:5) и (90:10).

Для анализа фармакологически активных алкалоидов часто используют обращенно-фазовое ВЭЖХ разделение на колонке с Zоrbах Есliрsе ХDВ-С (5 мкм). В качестве подвижной фазы служит смесь 0.1М фосфорной кислоты и ацетонитрила (85:15, v/v), C использованием УФ-детектора (330 нм); хорошие результаты могут быть получены при градиентном элюировании смесью 0.005 М Na2НРO4 (рН доводят Н3РO4 до 6) и ацетонитрила от 80:20 до 20:80 за 20 мин, при использовании УФ детектора (306 нм). Оптимальным является ВЭЖХ анализ алкалоидов на колонке с Осtаdесуl-С18 (5 мкм) сорбентом с использованием в качестве подвижной фазы смеси: метанол - 25% аммиак (10:0.2), при использовании УФ детектора (274 и 337 нм). Убедительные результаты были получены с использованием в качестве неподвижной фазы LiChrospher-100 RР18, (5 мкм). Подвижной фазой служил 70% метанол в 0.01 М ацетамиде при рН 8.04 (УФ-детектор 225 нм). Для разделения и анализа растительных алкалоидов используют также колонки с SS Васкосилом-II-5С18 RS (5 мкм), элюируя смесью ацетонитрила с водой при увеличении содержания ацетонитрила от 26 до 52% в течение 40 минут с использованием УФ-детектора с рабочей длиной волны 280 нм.

Вопросы для самоконтроля студентов

1 Сопоставьте взаимосвязь строения и реакционной способности растительных алкалоидов.

2 Что такое прото- и псевдоалкалоиды, каковы их структурные особенности и свойства.

50