Uchebnik

Помимо димеров, в растениях описаны тримеры, типа указанного выше и тетрамеры, объединенные в подгруппу «проантоцианидинов группы Т» (флаволаны), описанные, например, в Pavetta owariensis и др.:

Полифенолы корней герани кровянокрасной представлены 2 катехинами и 3 новыми глюкозидированными проантоцианидинами, структуры которых доказаны комплексом химических и спектральных данных:

132

Стадийный кислотный гидролиз позволил определить соотношение фенольных и углеводных компонент этих соединений – 1:1.5 (1), 1:1 (2), 1:2 (3) и тип связей между мономерами.

Основная роль конденсированных дубильных веществ в растениях – защитная от патогенов и механических повреждений, а для человека и животных – это своеобразные мембраны, осуществляющие процессы диализа, в том числе на опухолях.

Для многих мономерных структур и их димерных аналогов характерно наличие асимметрических атомов углерода и связанных с этим оптических изомеров и рацематов, которые обуславливают различия не только в физических и химических свойствах, но и в биодоступности и биоактивности.

Например, при ферментации чая из различных форм катехинов образуются оптически активные продукты конденсации – теафлавины с бензотрополоновым фрагментом и теарубигены (димерные и полимерные формы).

Под действием желудочного сока и повышенной кислотности, в организме димеры расщепляются до красителей – антоцианов, что делает их более биодоступными, повышая растворимость, способствуя укреплению стенок кровеносных сосудов и связыванию с металлами и анионами.

Наиболее распространенными бифлавоноидами являются структуры с

3,8’-, 6,8’-, 8,8’-, 5’,8’-, 5’,6-типами связи С-С и 4’,6-, 4’,4’-, 3,8’-, 6,6’-типами С-

О-С связей, причем мономерные фрагменты могут быть одинаковыми или разными: флавон-флавон, флаванон-флаванон, флавон-флаванон, флавонфлавонол и теафлавины 18 различных видов чая, содержание которых может увеличиваться при воздействии УФ-света, температуры и ферментов:

133

С наличием большого числа фенольных ОН-групп, особенно с рядовым расположением, связывают возможность дубильных веществ образовывать комплексы, хелаты или соли с белками, протеинами, алкалоидами, тяжелыми металлами, либо выводя их из организма или способствуя их биоактивности. Конденсированные дубильные вещества ограниченно растворимы в воде, поэтому их выделение из растений проводят экстракцией ацетоном или метанолом. Из сухого остатка экстракцией этилацетатом выделяют сумму димеров, дальнейшее отделение от мономеров и полимеров проводят на колонках капрона, перлона, сефадекса, целлюлозы, ионообменных смол. Сумму полученных димеров сразу же переводят в ацильные производные, а затем перацетаты разделяют на колонках кремневая кислота : целит 545 (1:1) из неполярных растворителей или вариантом препаративной хроматографии в тонком слое или на бумаге. Перацетаты разделяются достаточно хорошо, за исключением профизетинидина и пробинетидина, димеров брусники и конского каштана (тип А1 И А2).

Дубильные вещества конденсированного и смешанного типа отделяют от гидролизуемых добавлением 10% уксусной кислоты и 10% раствора ацетата свинца. При этом в осадок выпадают гидролизуемые дубильные вещества и остается черно-зеленый фильтрат при наличии конденсированных дубильных веществ.

Суммарные извлечения дубильных веществ можно разделять на индивидуальные компоненты с помощью хроматографических методов: адсорбционно-распределительной хроматографии на колонках целлюлозы, силикагеля или полиамида, ионообменной хроматографией на колонках катионита (Dauex-50), гель-хроматографией на колонках сефадекса G-50 или G-100.

134

Для предварительной очистки может быть использован метод диализа, лучшие результаты, при этом, получены при выделении высокомолекулярных флавоноидов и танинов, растворимых в воде и для смесей с сахарами и полисахаридами, а также растворимыми неорганическими компонентами растительных экстрактов.

Оптимальных результатов в разделении конденсированных дубильных веществ удалось достичь на неподвижной фазе Лихросорб RР8 с (10 мкм), Сферисорб гексил (5 мкм) и Гиперсил SАS (5 мкм) с УФ-детектором 280 нм. Предложена методика анализа и разделения конденсированных дубильных веществ на колонке [250x4] с Нуклеосилом-5 С18 при 450С с применением в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и 0.5М раствора фосфорной кислоты при повышении концентрации ацетонитрила и расходе подвижной фазы 0.75 мл/мин.

Применяя колонку [250x4.6] с Сферисорбом ODS (5мкм) при анализе конденсированных танинов в соке некоторых сортов французских яблок, удалось получить достаточно хорошие результаты при градиентном элюировании смесями: А (вода - 1М НСl 99.8:0.2) и В (метанол - 1М НСl 99.8:0.2) с повышением содержания В в А от 0 до 50% в течение 85 минут при расходе подвижной фазы 1.8 мл/мин и использовании УФ-детектора с переменной длиной волны.

При разделении и анализе смешанных танинов хороших результатов удалось достичь на колонке с Лихросфером RР18 (5 мкм) при повышении концентрации уксусной кислоты в смеси её с водой от 2 до 10% за 99 минут, при расходе подвижной фазы 0.5 мл/мин и на колонке Diasorb-130-С16Т при повышении концентрации ацетонитрила в 0.1М ортофосфорной кислоте от 0 до 15% за 180 минут, с дальнейшим элюированием смесью ацетонитрила и муравьиной кислоты при повышении концентрации ацетонитрила от 0 до 30% за 80 мин при расходе подвижной фазы 4 мл/мин при использовании УФдетектора 280 нм.

В качестве сорбентов для выделения, разделения и очистки дубильных веществ широко используются варианты жидкость-жидкостной хроматографии с использованием в качестве неподвижных фаз, помимо названных выше, адсорбентов аффинного типа. Перспективность использования химически модифицированных сорбентов связана со способностью дубильных веществ образовывать комплексы не только с биополимерами (эластазой, коллагеназой, желатином, альбумином и др.), но и с алкалоидами и другими азотсодержащими лекарственными веществами. Описано разделение компонентов дубильных веществ из корневища бадана, кровохлебки, лапчатки, змеевика, коры дуба методом нетрадиционной аффинной хроматографии.

Различить катехины, димерные проантоцианидины и конденсирован-

ные флаваны можно по их положению на бумажной хроматограмме: высокомолекулярные флаваны образуют «дорожки» от точки нанесения по движению водных систем, в зависимости от молекулярной массы - чем ниже масса, тем выше фронт «дорожки».

135

Бифлавоноиды, их перметиловые эфиры, хинокифлавоны (4-O-8’-, 4-

О-6’-межфлавановые связи), аментофлавоны (3,8’-, 3,6’- связи) делят в системе бензол - пиридин - этилформиат – диоксан 5:1:2:2 в тонком слое силикагеля.

Для варианта двумерной хроматографии на бумаге используют системы растворителей: н-бутиловый спирт - уксусная кислота - вода в соотношениях 6:1:8, 4:1:5, 40:12.5:29, в одном направлении и кислота уксусная 2%, 6% и 15% - во втором. Для одномерной бумажной хроматографии применяют системы соляная кислота - уксусная кислота - вода (3:3:1), н-бутиловый спирт - уксусная кислота - вода - этиленгликоль (4:1:5:1), муравьиная кислота - соляная кислота - вода (5:3:2), н-бутиловый спирт - соляная кислота - вода (7:2:5).

Для хроматографии в тонком слое сорбента более пригодны системы: ацетон - вода - пиридин (20:4:1), бензол - метиловый спирт - пиридин (16:2:1), бензол - этиловый спирт (1:1), бензол-ацетон (1:5, 1:4, 1:3).

Ниже приведена схема разделения катехинов и гликозидов, которую можно использовать для любого катехин-содержащего сырья:

136

Химические свойства конденсированных дубильных веществ

По химической природе дубильные вещества являются полифенолами и для них характерны все реакции, указанные в разделах: фенолы, фенолокислоты и флавоноиды. При этом, поскольку основу гидролизуемых дубильных веществ чаще составляют галловая, м-дигалловая и эллаговая кислоты, которые являются производными пирогаллола, с раствором ЖАК и солей железа окисного они дают черно-синее окрашивание или осадки, как и пирогаллол.

Конденсированные дубильные вещества содержат звенья пирокатехина и с указанными реагентами дают темно-зеленое окрашивание или осадки.

Достаточно надежной для различия пирогалловых и пирокатехиновых танинов является реакция с нитрозометилуретаном, который осаждает

пирокатехиновые дубильные вещества при кипячении.

К извлечению добавляют по каплям бромную воду (5 г брома в 1 л воды) до появления запаха брома, выпадает осадок (конденсированные дубильные вещества и катехины).

Специфика химических свойств конденсированных дубильных веществ связана с молекулярной массой, количеством, расположением, природой заместителей и типом связи. В кислой среде, особенно при нагревании связь С-О-С разрывается быстро и полное расщепление проходит в течение 2-10 часов в растворе от 7 до 20% концентрации кислоты.

Полимерные флавоноиды (флаволаны) трудно растворимы в воде,

лучше при нагревании и в водно-органических растворителях. При температурах выше 800С и при действии кислот выше 7% концентрации флаволаны превращаются в продукты более высокой степени конденсации - флобафены и осаждаются.

Флаволаны образуют нерастворимые окрашенные комплексы с солями алюминия, железа, тяжелых металлов.

При кислотном гидролизе менее 7% концентрации кислоты из флаволанов образуются антоцианидины, например:

137

 Проантоцианидины образуют перацетаты, соответственно по всем ОНгруппам, а при реакции метилирования диазометаном образуется метоксипроизводное на 2 ОН группы меньше, т.к. алифатические ОН-группы в эту реакцию не вступают. Это же свидетельствует и о том, что эти две ОН-группы не участвуют в межфлавановой связи.

В проантоцианидинах этой группы 5 асимметрических атомов углерода и теоретически возможны 32 оптических изомера. Но так как мономеры, соответствующие этим димерам, встречаются в растениях обычно в двух наиболее устойчивых формах – транс-форме с 2R3S-конфигурацией ((+)- катехин) или цис-форме с 2R3Rконфигурацией ((-)-эпикатехин), то количество возможных изомеров сокращается до восьми.

Редким является процианидин пальмы, образованный конденсацией (+)- эпикатехина. Четыре из возможных 8 димеров группы В названы условно В1- В4:

При кислотном гидролизе из димера В1 образуется цианидин и (+)- катехин, из димера В2 в тех же условиях получается вместо (+)-катехина - (-)- эпикатехин и т.д.

Стерическое строение «верхних» половин молекул димеров группы В определяют по реакции расщепления с тиогликолевой кислотой. Таким образом, зная химические особенности поведения мономерных молекул, можно предположить возможные направления в реакциях их полимеризации и конденсации. Хэслам, исследовав 29 видов различных растений, обнаружил еще 4 диастереоизомера, которые при детальном изучении их свойств оказались парными, к указанным выше димерам, т.е. димер В5 соответствует

димеру В2, В6 В3, В7 В1, и В8 В4.

138

Эти димеры различаются либо формой межфлавановой связи С8-С4 или С6- С4, либо конфигурацией асимметрического центра у С4, или они являются ротационными изомерами по межфлавановой связи В2 и В5, В1 и В7 - «верхняя» часть молекул - (-)-эпикатехин; В3 и В6. В4 и В8 - «верхняя» часть молекул - (+)- катехин:

 В растениях димеры группы А образуются, вероятно, по схеме:

Соединения этой группы под действием минеральных кислот расщепляются с образованием красителя – антоцианидина и флаван-3-ола, однако для гидролиза требуется большая концентрация кислоты (0.5н НСl).

 При ацилировании всех димеров группы А получены нонацетаты, а при метилировании диазометаном образуются гептаметиловые эфиры. Если после метилирования проводить реакцию ацилирования, это приводит к получению диацетилгептаметилового эфира. Структура этих соединений не может быть однозначно определена на основании химических свойств полифенолов, поэтому для димеров каштана, как наиболее вероятная предложена формула:

139

 Для определения конфигурации молекул предложено проводить расщепление димеров толуолтиолом, при этом тиоэфир «верхней» молекулы при восстановлении никелем Ренея образует соответствующий катехин. Схема реакции изображена ниже:

Димерные проантоцианидины группы А имеют на 2 атома водорода меньше, чем проантоцианидины группы В, это наводит на мысль о существовании второй межфлавановой связи. Из 12 атомов кислорода 9 соответствуют ОН-группам, что подтверждается в реакциях ацилирования.

140