Uchebnik

Качественные реакции на иридоиды:

Универсального метода, однозначно определяющего наличие иридоидов в растениях не существует, однако 4 реакции являются тестовыми:

Добавляют 1-2 мл реактива Трима-Хилла (смесь 5 мл кислоты хлороводородной концентрированной, 10 мл 0.2% раствора меди сульфата и 100 мл кислоты уксусной ледяной), нагревают до кипения, появляется интенсивное синее окрашивание (аукубин, монотропенин, асперулозид);

красно-фиолетовое окрашивание (гарпагид). Логанин, каталпозид, каталпол,

вербеналин не дают характерного окрашивания.

Добавляют 1-2 мл кислоты серной концентрированной, нагревают до температуры 1000С, прибавляют 3-5 капель 0.5% водного раствора аммония ванадата в кислоте серной, появляется синее окрашивание, которое вскоре обесцвечивается.

Добавляют 2-3 мл реактива Шталя (5 мл кислоты хлороводородной концентрированной, 50 мл спирта этилового 95%, 1 г п-диметиламинобенз- альдегида, добавляют до 100 мл спиртом этиловым), появляется сине-зеленое окрашивание.

ТСХ (силуфол), хлороформ – метанол 9:1, 1100С, через 5-8 минут, синезеленое окрашивание.

Методы выделения иридоидов из растений

Общим во всех известных методах выделения иридоидов является предварительная двух-, трехкратная экстракция растительного материала водой или метиловым (реже этиловым) спиртом при температуре 40-700С, концентрирование экстракта досуха, растворение в воде очищенной и обезжиривание обработкой диэтиловым эфиром или хлороформом.

Водный остаток, после обезжиривания эфиром, можно разделить на сополимере стирола и дивинилбензола с последовательным элюированием водой, 50% водным метанолом, метанолом и ацетоном.

Водорастворимую часть наносят на колонку с оксидом алюминия, полиамидом СС или силикагелем L70/230, элюируют водой и водным метанолом 1:1. Обычным является рехроматографирование на том же сорбенте, но с менее полярными элюентами.

Дробное разделение суммы различных по природе иридоидов на индивидуальные компоненты возможно с использованием только метода адсорбционно-распределительной хроматографии на колонке с силикагелем L70/230 последовательно элюируя смесями: гексан - этилацетат (от 1:1 до 1:9) и этилацетат - метанол (50:1). Для выделения ацилированных иридоидов гексанэтилацетатный экстракт рехроматографируют на колонке с тем же сорбентом, элюируя дихлорметан - метанол – вода 50:3:1. Элюирование смесью дихлорметан - метанол - вода 30:3:1 на колонке с силикагелем L70/230 этилацетат-метанольного (50:1) экстракта дало возможность выделения индивидуальных оксииридоидов.

241

Для более тонкого разделения смеси иридоидов водорастворимую часть предварительно подвергают фракционированию растворителями различной полярности: гексан, дихлорметан, этилацетат и н-бутанол, с последующим хроматографированием на одном из указанных сорбентов, либо гельфильтрацией на сефадексах (чаще всего LH-20).

Поиску оптимальных методик анализа иридоидов в тонком слое посвящено множество работ, предложено несколько десятков различных хроматографических систем. Так, для разделения, сравнительной идентификации и препаративного выделения предлагается использовать системы: этилацетат - пропанол-2 - вода 6:3:1, хлороформ – метанол – вода – муравьиная кислота

75:24:1:0.2, хлороформ – метанол – вода 60:22:4 и 60:15:4 (нижний слой).

Помимо указанных систем, наиболее часто используются: хлороформ – метанол – вода 80:20:2, 7:2:1 и 61:32:7, а также этилацетат – метанол (9:1). Для выделения и анализа иридоидов, а также их количественного анализа может быть использован метод ВЭЖХ.

Для препаративного выделения иридоидов предложено использовать 5% водный метанол с добавлением 15 мкл ортофосфорной кислоты на 100 мл подвижной фазы, УФ-детектор при 223 нм и 30% водный метанол с добавлением 0.5% уксусной кислоты.

Градиентным элюированием смесями А (0.15% уксусная кислота) и В (метанол), с увеличением содержания А в В от 25 до 90% за 40 мин предложено анализировать сумму иридоидов Wulfenia carinthiaca. Другим вариантом элюентной системы может служить ацетонитрил – вода (25:75), с использованием рефрактометрического детектора.

Наиболее удачной системой при методе БХ является бутанол – уксусная кислота – вода 63:10:27, а проявление реагентами с последующим нагреванием:

2 г ванилина в 100 мл метанола и 4 мл НСl кoнц.

0.5 г бензидина в 20 мл уксусной кислоты и 80 мл этанола.

5 г резорцина в смеси 296 мл этанола и 4 мл Н2SО4 конц.

2% спиртовый раствор флороглюцина с последующим опрыскиванием НСl конц.

0.5 мл анисового альдегида в смеси 9 мл 95% этанола и 0.5 мл

Н2SО4 конц.

пары йода

2н водный раствор Н2SО4

Химические свойства иридоидов

Иридоидные гликозиды легко гидролизуются на агликон и сахар. При стоянии агликоны легко полимеризуются в темно-коричневые пигменты. Этот химический процесс происходит в растениях при участии ферментов и наиболее часто возможен при неправильной сушке сырья и его хранении при повышенной влажности – сырье буреет («явление черной пигментации»).

242

 Из химических методов исследования чаще других используют энзиматический, кислотный и щелочной гидролиз, каталитическое гидрирование и получение производных.

 Поскольку агликоны иридоидов легко полимеризуются с образованием трудно растворимых темно окрашенных продуктов, кислотный гидролиз используется лишь для выделения и идентификации углеводной части молекул:

 Щелочной гидролиз природных гликозидов чаще используют для идентификации кислотных фрагментов ацилированных гликозидов и идентификации агликонов. Так, гидролиз 0.1н раствором NaОН пентаацетата вероникозида приводит к образованию бензойной кислоты и каталпола; из антирринозида получен 7-оксигарпагид с раскрытием эпоксицикла: из глобуларимина получена коричная кислота и дезацилглобуларимина:

243

Недозированное каталитическое восстановление иридоидов приводит к образованию производных иридана.

Описано избирательное восстановление кето-группы с сохранением С3=С4 в уксусной кислоте в присутствии платины:

Эпоксицикл иридоидов раскрывается при восстановлении алюмогидридом лития:

В качестве теста на наличие эпоксицикла используют реакцию с тиосульфатом натрия в присутствии фенолфталеина.

 Наличие С3=С4 или других двойных связей проявляется при взаимодействии с Вr2 при слабом нагревании, а в щелочной среде при нагревании образуется эпоксицикл, определяемый по реакции с тиосульфатом и углеводный фрагмент, как результат щелочного гидролиза, который идентифицируют методом БХ в сравнении со стандартными образцами углеводов:

244

 На основе аукубина осуществлена серия реакций, которые использованы, с одной стороны, для доказательства его структуры, а с другой – для получения новых биологически активных аналогов:

Структуры всех полученных продуктов доказаны комплексом спектральных и химических методов.

УФ-спектры иридоидов отличает наличие максимумов поглощения в области 188-218 нм или 229-249 нм (практически одинаковой интенсивности), в зависимости от типа заместителя при С4 агликоновой части молекулы. Первая область характерна для енол-эфирной части, незамещенных при С4, второй интервал – для енол-эфирной части молекулы, сопряженной с С=С – связью.

Сдвиг полос возможен от наложения поглощения заместителей, что одновременно является подтверждением их наличия.

В ИК области для всех ∆3-ненасыщенных гликозидов характеристичным считают слабое поглощение в области 1620-1670 см-1 (С=С), однако эта область может перекрываться при наличии в структуре карбонильных групп (кетоны, альдегиды); остальные характеристичные области поглощения являются общими для любых органических молекул, имеющих аналогичное замещение.

ПМР-спектры иридоидов рассматривают как характер вклада резонанса протонов агликоновой части и заместителей. Сигналы протонов циклопентанового кольца являются диагностическими при использовании метода двойного резонанса.

Часто в ПМР-спектрах идентифицируют общее число протонов и специфику резонанса, в зависимости от особенностей подгруппы иридоидов.

Сигналы аномерных протонов углеводных фрагментов проявляются в области 4.7-5.4 м.д. и имеют вид уширенного синглета или выраженного дублета, в зависимости от α- или β- типа аномера. Константы спин-спинового взаимодействия J1,9, J5,6, J5,9, J6,7, J7,8, J8,9 играют важную роль при

245

конформационном анализе агликонового скелета иридоидных гликозидов, в частности, при определении относительной конфигурации центров асимметрии, при наличии в них заместителей. Например, для иридоидов аукубиновой группы J1,9=4.5-7 Гц, для производных каталпола J1,9=6.2-10 Гц, для производных декалозида J1,9=5.1-6.0 Гц, дециозида J1,9=9.2-10 Гц, и т.д. Эти расхождения связаны с различными конформациями циклопентанового и дигидропиранового циклов, сохраняющих во всех случаях β-ориентацию Н-С9 и α-ориентацию Н-С1. Низкие значения J1,9 (0-2 Гц) соответствуют экваториальной ориентации Н-С1, высокие (5-10 Гц) - аксиальной Н-С1.

Недостатков ПМР-спектроскопии лишена 13С-ЯМР-спектроскопия иридоидов, а редкие случаи наложения сигналов дифференцируют частичным подавлением спин-спинового взаимодействия.

Метод масс-спектрометрии в анализе иридоидов не нашел столь широкого применения, как 1Н- и 13С-ЯМР.

Характерным актом фрагментации молекулярных ионов является отщепление углеводной части. Информативность увеличивается, если возможно сравнение масс-спектров исходного соединения и его ацетата.

Самым надежным методом определения абсолютной конфигурации иридоидов является рентгеноструктурный анализ.

Метод оптического вращения позволяет однозначно определить аномерный центр и конфигурацию заместителей при С-1.

Унедозид

С14Н20О9 Тпл. 232-2340С, [α]D -112.40.

1Н-ЯМР (D2О, δ, м.д.): 4.91 (d, J=9.8, Н-1); 6.41 (dd,

J=9.8, Н-3); 5.18 (m, J=6, J=2, Н-4); 2.24 (m, J=6, J=4.5,

Н-5); 4.08 (d, J=7.5, J=1.5, H-6); 3.66 (dd, J=2.7, J=1.5, H- 7); 3.87 (d, J=2.7, H-8); 2.59 (dd, J=7.2 , J=9.8, J=0.6, H- 9); 4.85 (d, J=7, Н-1).

m/z (70 eV): 332, 283, 255, 170, 169, 168, 162, 153, 152, 151, 145, 136, 135, 125, 124, 123, 115, 111, 109, 109, 107, 87, 85, 81(100), 79

Вербаскозид А. С31Н40О16. [α]D -2150.

УФ (МеОН, λmax, нм): 200-222, 312.

ИК (КВr, ν, см-1): 3600-3200, 1700-1655, 1640, 1630, 1600, 1515.

1Н-ЯМР (DMSO-d6, δ, м.д.): 4.98 (d, J=8.5, Н-1); 6.36 (dd, J=6, J=1.6, Н-3); 5.01 (dd, J=6, J=5.4, Н-4); 2.30 (m, J=1.6, J=4.5, J=8.0, J=7.5, Н-5); 3.9 (brd, Н-6); 3.6 (brs, J=1, Н-7); 2.45 (dd, Н-9); 4.0-3.85 (2H, s, H-10); 4.97 (d, J=7.5, H-1’); 3.2- 4.1 (m, Н-2,3,4,5,2”,3”); 4.9-6.0 (d, J=1.2, Н-1”); 3.8-4.1 (m, Н-5”); 4.97-5.15 (m, Н-4”); 1.16 (3Н, d, J=6.2, H-6”); 7.00 (d, J=9, J=2, Н-2’”,6’”); 6.40 (d, J=15.5, Н-α);

7.68 (d, J=15.5, Н-β); 3.83 (3H, s, ОСН3)

13С-ЯМР (DМSО-d6, δ, м.д.): 93.30 (C-1); 140.84 (C-3); 102.30 (C-4); 35.64

(C-5); 82.12 (C-6); 57.60 (C-7); 65.31 (C-8); 41.90 (C-9); 59.38 (C-10); 97.99 (C- 1’); 73.55 (C-2’); 77.23 (C-3’); 70.76 (C-4’); 76.42 (C-5’); 61.42 (C-6’); 98.88 (C- 1”); 70.21 (C-2”); 68.43 (C-3”); 73.75 (C-4”); 66.57 (C-5”); 17.45 (C-6”); 126.66 (C- 1’”); 129.81 (C-2’”,6’”); 114.32 (C-3’”,C-5”’); 161.18 (C-4”’); 115.48 (C-α); 144.30 (C-β); 55.21 (CH3O).

Гептаацетат, Tпл. 1120C.

Литантосалин С24Н28О10. [α]D -84.440 (MeOH)

УФ (MeOH, λmax, нм): 204 (4.36), 216 (4.1), 222 пл., 278 (4.42). ИK (КВr, ν, см-1): 3450, 1710, 1655пл, 1635, 1580, 1450.

1Н-ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 4.95 (d, J=7, Н-1); 6.33 (dd, J=2, J=6.5, Н-3); 5.11 (dd, J=4, J=6, H-4); 2.58-2.78 (m, H-5); 4.38-4.54 (m, H-6); 5.8 (dd, J=1.5, J=1, Н- 7); 2.96 (ddd, J=7, J=1, H-9); 4.94 (m, H-10); 7.72 (d, J=16, H-α); 6.54 (d, J=16, H- β); 4.69 (d, J=7, H-1’).

13С-ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 97.89 (C-1); 141.58 (C-3); 105.48 (C-4); 46.08 (C- 5); 82.65 (C-6); 132.46 (C-7); 142.35 (C-8); 48.15 (C-9); 63.50 (C-10); 100.07 (C- 1’); 74.67 (C-2’); 77.94 (C-3’); 71.25 (C-4’); 77.67 (C-5’); 62.61 (C-6’); 135.42 (C- 1”); 129.91 (C-2”,C-6”); 129.21 (C-3”,C-5”); 131.51 (C-4”); 118.42 (C-α); 146.60 (C-β); 168.42 (CO).

Пентаацетат: [α]D -124.30 (CHCl3)

m/z (70eV): 686 (М+), 627, 339, 331, 279, 271, 221, 131, 109(100), 77.

247

Глобуларин С24Н30О12. [α]D -84,470 (MeOH)

УФ (MeOH, λmax, нм): 216 (4.11), 222 пл., 278 (4.41). ИK (КВr, ν, см-1): 3410, 1698, 1636, 1580, 1498, 1450.

1Н-ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 5.28 (d, J=6, Н-1); 6.31 (dd, J=6.5, J=2, Н-3); 5.12 (dd, J=6.5, J=3, Н-4); 2.84-2.58 (m, Н-5); 4.0-3.5 (m, Н-6, H-7); 2.40 (dd, J=10, J=6, Н-9); 4.55, 4.34 (d, J=12, H-10); 7.70 (d, J=16, Н-α); 6.54 (d, J=16, Н-β); 4.65 (d, J=7, H-1’).

13С-ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 96.29 (С-1), 141.61 (С-3), 106.40 (С-4), 38.86 (С- 5), 78.63 (С-6), 78.63 (С-7), 81.36 (С-8), 44.59 (С-9), 69.01 (С-10), 100.87 (С-1’), 74.35 (С-2’), 77.78 (С-3’), 70.83 (С-4’), 77.43 (С-5’), 62.23 (С-6’), 135.37 (С-1”), 129.86 (С-2”), 129.16 (С-3”), 131.45 (С-4”), 129.16 (С-5”), 129.86 (С-6”), 146.52 (С-α), 118.60 (С-β), 169.03 (С=О).

Гексаацетат: [α]D -97.06 (CHCl3) Гептаацетат: [α]D -95.03 (CHCl3)

Патрионазид

С21Н34О11. Тпл. 97-980C, [α]D -45.40 (MeOH). ИК (КВr, ν, см-1): 3370, 1740, 1660.

Гексаацетат: Tпл. 130-131.50C, [α]D -45.70 (EtOH).

1Н-ЯМР (СDCl3, δ, м.д.): 5.86 (d, J=6, Н-1); 6.25 (d, J=1.5, Н-3); 2.7-2.2 (m, Н-5, H-6); 4.05-

4.20 (4Н, H-10, H-11); 1.95-2.10 (6Ас); 0.96 (6H,

d, J=6, H-4”).

13С-ЯМР (D2О, δ, м.д.): 93.5 (C-1), 140.0 (C- 3), 116.1 (C-4), 33.0 (C-5), 39.6 (C-6), 72.6 (C-7), 47.8 (C-8), 41.8 (C-9), 61.3 (C-10), 69.0 (C-11), 103.3 (C-1’); 175.9 (C-1”), 43.8 (C-2”), 26.2 (C- 3”), 22.4 (C-4”).

248

6-O-п-оксибензоил-6-эпиаукубин

С22Н26О11. [α]D -87,60С (МеОН),

ИК (КВr, ν, см-1): 3350, 2930, 1690, 1650, 1620,

1600, 1520, 1310, 1280, 1180, 1030, 860, 780.

1Н-ЯМР (D2О, δ, м.д.): 7.66, 6.78 (4Н-Аr, J=8);

6.30 (dd, J=6, J=1.5, Н-3); 5.95 (m, Н-7); 5.95

(brd, Н-6); 4.98 (d, J=7, Н-1); 4.93 (dd, J=4, J=6, Н-4), 4.7 (d, J=7, Н-1’); 4.35 (2H, brs, H-10); 2.5-

3.1 (m, Н-5, H-9).

13С-ЯМР (D2О, δ, м.д.): 98.7 (C-1), 142.7 (C-3), 102.0 (C-4), 40.1 (C-5), 79.7 (C-6), 60.7 (C-10), 99.2 (C-1’); 73.6 (C-2’); 76.4 (C-3’); 70.0 (C-4’); 121.7 (C-1”), 132.2 (C-2”), 115.8 (C-3”), 161.3 (C-4”); 115.8 (C-5”).

Нигрозид 2.С30Н38О14 [α]D -1420C (MeOH).

ИК (КВr, ν, см-1): 3400,1705,1650, 1640,

1577, 1450.

1Н-ЯМР (СD3ОD, δ, м.д.): 4.9 (s, Н-1); 6.32

(dd, J=6, J=1.5, Н-3); 5.1 (dd, J=6, J=3.5, Н-

4); 2.8-2.9 (m, Н-5, H-9); 4.46 (m, Н-6); 5.87

(brs, Н-7); 4.65 (d, J=7.6, H-1’); 4.87 (d,

J=1.6, H-1”); 5.05 (dd, J=1.6, J=3.4, H-2”);

3.45 (t, J=9.3, Н-4”); 1.28 (d, J=6.1, H-6”);

7.72 (d, J=16, H-β); 6.75 (d, J=16, H-α); 7.38, 7.60 (5Н-Аr, m).

13С-ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 97.98 (С-1), 141.92 (С–3), 105.37 (С-4), 44.36 (С-5), 149.67 (С-8), 61.47 (С-10), 99.95 (С-1’), 74.92 (С-2’), 78.29 (С-3’), 71.57 (С-4’), 77.89 (С-5’), 74.63 (С-2”), 70.57 (С-3”), 74.32 (С-4”), 70.31 (С-5”), 18.12 (С-6”), 135.64 (C-1’”); 129.94 (C-2’”); 129.23 (C-3’”); 129.94 (C-6’”); 118.62 (С- α), 146.75 (С-β), 167.94 (С=О).

m/z (70eV) гептаацетата: 361, 331, 271, 211, 191, 170, 169, 161, 157, 145, 139, 132, 131(100), 127, 111, 109, 103.

Примеры установления структур иридоидов

Необычная димерная и две мономерные структуры иридоидного типа выделены из растений Sedum и Pseudosedum:

249

(1) -Метиловый эфир 12’,10-ди-1-О-β-D-глюкопиранозилокси-8-метил- 8-окси-тетрагидроциклопента[C]пиран-4-карбоновой кислоты отнесен к классу иридоидов на основании сине-зеленого окрашивания с реактивом Шталя и синего, переходящего при стоянии в бесцветное с кислотой серной концентрированной и 0.5% водным раствором аммония ванадата при температуре 1000С. При проведении стадийного кислотного гидролиза вещества, отмечено образование D-глюкозы, идентифицированной сравнением с аутентичным образцом, полупродукта реакции и агликона. Щелочной гидролиз вещества показал образование двух полупродуктов, дающих с реактивом Шталя сине-зеленое окрашивание, что указывает на наличие сложноэфирных групп в исследуемой молекуле.

Наличие 2-х углеводных фрагментов в структуре вещества подтвердилось последовательным отрывом глюкозидных фрагментов при анализе его масс-

спектра (осколочные ионы: 601 [M-Glu]+, 422 [M-Glu-Glu]+, 179 [Glu-Н]+ и 163 [Glu-ОН]+ m/z), что соответствует образованию в условиях стадийного кислотного гидролиза 2 полупродуктов. Осколочные ионы при 404, 387 и 359 m/z подтверждают сложноэфирную природу вещества, а ионы 85, 84, 83, 57, 55, 41 и 39 m/z - наличие пиранового фрагмента.

Наличие в структуре молекулы гидроксильных и сложноэфирных групп подтверждается данными ИК-спектра (3500, 3399 (ОН), 1728 (-СОOR) см-1).

Максимум поглощения соединения в УФ-области (239 нм) является характеристичным для иридоидов с тетрагидроциклопента[C]пирановым скелетом.

Молекулярная масса и две группы сигналов в ПМР- (Н-1-10 и Н-1”’-10”’) и 13С-ЯМР-спектрах (С-1”-11” и C-1””-11””) указывают на димерную природу вещества. Наличие двух групп идентичных сигналов D-глюкозы в 13С-ЯМР- спектре в области от 99.8 до 62.7 м.д. указывает на равноценность этих заместителей, а отсутствие сдвига соответствующих резонансных сигналов 2-6 углеродных атомов углевода, по сравнению с 13С-ЯМР-спектром D-глюкозы является доказательством незамещенности 2-6 гидрокси-групп обоих углеводных фрагментов.

Сигнал аномерных протонов D-глюкозы при 5.76 и 5.42 м.д. свидетельствует о ее β–конформации.

Сравнение 13С-ЯМР-спектра соединения со спектрами иридоидных D- глюкопиранозидов выявило его сходство со спектром 1-О-β-D-глюко- пиранозилокси-8-метил-8-окситетрагидроциклопента-[C]пиран-4-карбоновой кислоты, однако оказалось, что они отличаются отсутствием у модельного соединения метокси-группы (51.7 и 3.69 (3H, s, OMe) м.д.), а также сдвигом сигналов Н-10 и С-10 в низкочастотную область (67.2 24.6 м.д. и 3.61 (2H) 1.31 (3Н) м.д.), что указывает на наличие акцепторного заместителя у С-10 исследуемой молекулы и т.о. на 12’,10тип связи между мономерными фрагментами.

Вещества 2 и 3 отнесены к классу иридоидных гликозидов, поскольку в продуктах стадийного кислотного гидролиза были обнаружены D-галактоза, установленная сравнением с аутентичным образцом и иридоидный агликон, образующий, также как и исходное вещество, сине-зеленое окрашивание с

250