недостаточно для эффективного противодействия вирусному заражению [49]. В любом случае, становится очевидным, что активация Nrf 2, проявляя выраженный противовоспалительный и антиоксидантный эффект, должен стать весьма важным благоприятным фактором в комплексном терапевтическом воздействии при COVID-19 [50,51].

Флавоноиды и SARS-CoV-2 в экспериментах in vitro

Широко применяемые сегодня методы виртуального скрининга требуют подтверждения в экспериментах in vitro с использованием различных клеточных технологий. С этой целью наиболее часто используются такие биохимические и биофизические методы как флуоресцентный резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), иммуноферментный анализ (ELISA), анализ связывания поверхностного плазмонного резонанса (SPR), термического сдвига (TSA), изометрической титрационной калориметрии (ITC), исследование цитопатического эффекта (CPE) и другие. При FRET-анализе фиксируется перенос энергии между двумя флуоресцентными белками от донора к акцептору в флуорогенном субстрате. Этот перенос возникает при расщеплении вирусной протеазой линкеров, удерживающих от взаимодействия эти хромофоры, находящиеся поблизости друг от друга. С помощью метода SPR удается обнаруживать оптические биосенсоры, что позволяет измерить взаимодействие между протеазой и изучаемым лигандом путем мониторинга изменения показателя преломления поверхностной границы раздела, которое происходит в процессе их связывания. TSA-анализ позволяет зафиксировать изменение температуры термической денатурации белка и, следовательно, его стабильности в условиях взаимодействия с лигандом. С помощью ITC напрямую измерют тепло, которое выделяется или поглощается в процессе связывания протеазы с лигандом [52-57].

Анализируя изменения ферментативной активности SARS-CoV-2 3CLpro, отметим, что из протестированных флавонолов, как и в исследованиях in silico, высокую степень эффективности продемонстрировал кверцетин. В скрининге библиотеки из 150 соединений кверцетин проявил себя как довольно мощный ингибитор основной протеазы SARS-CoV-2 при применении методов FRET, TSA и ITC с рассчитанной константной ингибирования Ki ~ 7 мкм [58,59]. При этом цитируемые авторы полагают, что кверцетин оказывает зависимое от концентрации дестабилизирующее влияние на термическую стабильность протеазы 3CLpro, действуя как конкурентный ингибитор ее активного сайта [58]. В исследовании in vitro концентрация кверцетина, обеспечивающая подавление 50% активности SARS-CoV-2 (IC50), составила 93,5 мкм, что, как правило, превосходит аналогичный показатель у его гликозилированных производных [13]. В этой связи высказано предположение, согласно которому степень ингибирования протеазы 3CLpro SARS-CoV-2 в значительной мере зависит от места гликозилирования молекулы кверцетина и расположения гидроксильных групп в его

129

относительно ингибирования протеазы 3CLpro и последующей репликации вируса вызывают байкалеин и его гликозид байкалин. Использование клеточной линии Vero CCL-8 из почек африканской зеленой обезьяны, инфицированной вирусом, показало, что байкалеин и байкалин в концентрации 20 мкм на 99,8% и 98% соответственно ингибировали SARS-CoV-2. При этом байкалеин проявил более сильную ингибирующую активность с полумаксимальной эффективной концентрацией (EC50) 4,5 мкм и EC90 = 7,6 мкм [69]. В другом исследовании после обработки клеток Vero байкалеином в течение 1 часа их инфицировали вирусом на протяжении 2 часов и с помощью РТ-ПЦР определяли вирусную РНК в этих клетках. В описанных условиях байкалеин ингибировал репликацию SARS-CoV-2 с ЕС 50 = 2,9 мкм [70]. В аналогичных экспериментах на клетках Vero E6 байкалин и байкалеин дозозависимо подавляли репликацию того же вируса с EC50 10,27 и 1,69 мкм соответственно [71]. В другой работе, выполненной в сходных условиях, EC50 для байкалина составила 27,87 мкм [19]. При этом оба соединения продемонстрировали очень низкую токсичность: при CCK8 анализе их CC50 концентрация была выше 200 мкм [71,72]. FRET-анализ позволил выяснить, что подавление репликации SARS- CoV-2 в значительной степени обусловлено ингибированием основной протеазы 3CLpro. Так, выяснилось, что при применении байкалеина и байкалина наблюдалось угнетение активности 3CLpro SARS-CoV-2 с IC50 0,94 и 6,41 мкм соответственно [71]. При этом байкалин в концентрации 50 мкм снижал активность протеазы на 41% с IC50 83,4 мкм [70]. Способность ингибировать активность 3CLpro SARS-CoV-2, очевидно, свойственна и ряду других флавонов и близких им соединений [10,59,60,67,70,73].

Из флаванонов, способных умеренно ингибировать активность 3CLpro SARS-CoV-2, отметим гесперидин, гликозилированное производное флаванона гесперетина, и в большей степени – нарингенин. По сведениям, приведенным T.T.H.Nguyen и соавторами [60], нарингенин, гликозилированное производное флаванона нарингина, на 57% угнетал активность 3CLpro, воспроизведенную в E.coli внесением в бактерию нуклеотидной последовательности, кодирующей основную протеазу SARS-CoV-2. Эффект нарингенина при этом более чем в 2,5 раза превосходил ингибирующую активность нарингина, что авторы связывают с гликозилированием молекулы нарингенина в положении C7. При FRET-анализе IC50 нарингенина составила 50±10 мкм [60]. В интересном исследовании in vitro, проведенном итальянскими авторами, добавление нарингина перед инфицированием клеток Vero E6 вирусами HCoV-OC43 и HCoV-229E значительно ингибировало их репликацию [74]. После этого клетки Vero E6 инфицировали с помощью SARS-CoV-2 и в течение 48 и 72 часов контролировали развитие цитотоксического эффекта. При добавлении нарингенина во внешнюю среду фиксировали более чем на 90% ослабление CPE через 48 часов. Эффект сохранялся и через 72 часа при применении флаванона в дозах 62,5 и 250 мкм. При этом

131

Касаясь влияния флавоноидов на активность PLpro SARS-CoV-2 in vitro, отметим, что здесь литературных данных значительно меньше, чем в отношении 3CLpro SARS-CoV-2. Это может быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, таких исследований проведено намного меньше. Во-вторых, не исключено, что влияние флавоноидов на эту протеазу коронавируса существенно слабее. По-видимому, обе причины имеют значение.

Первоначальный скрининг in silico позволил из 300 фенольных соединений отобрать для исследования in vitro 30 наиболее перспективных в отношении влияния на протеазу PLpro. Среди них оказались два флавоноида рутин и цианидин-3-О-гликозид, проявившие эффект в микромолярном диапазоне. Выяснилось, что указанные лиганды в концентрации 100 мкм ингибировали 38% и 20% активности PLpro SARS-CoV-2 соответственно без определения IC50 [85]. Проведенный in vitro скрининг катехинов зеленого чая, показал, что один из экстрактов, содержавший 56,6% ECG, 5,7% кемпферола, 4,4% EGCG и 3,8% кверцетина мощно угнетал протеазу PLpro. Интересно, что ингибирующий эффект этого экстракта в 10 раз превосходил действие одного ECG (IC500,13±0,001 и 11,62±0,47 мкг/мл соответственно). Следовательно, и другие флавоноиды, входящие в состав экстракта, проявили выраженную антипротеазную активность [86]. В экспериментах in vitro было показано, что гликозилированный флавон байкалин кроме ингибирования 3CLpro SARS-CoV-2 зависимо от концентрации угнетал активность протеазы PLpro этого вируса с IC50 178 мкм. При этом протеаза PLpro проявила более высокую чувствительность к байкалину, чем 3CLpro [87]. Хотя в другом исследовании с использованием FRET-анализа было показано, что степень ингибирования байкалином и байкалеином PLpro SARS-CoV-2 уступала эффекту в отношении 3CLpro [65].

Еще в исследовании J.Y.Park и соавторов было зафиксировано, что ингибирующий эффект в отношении активности PLpro SARS-CoV у пренилированных флавоноидов значительно возрастает. Так, наиболее мощным ингибитором PLpro (более сильным, чем 3CLpro) оказался пренилированный флавон папирифлавонол А, превзошедший эффект кемпферола, кверцетина и кверцетин-β-галактозида, с показателем IC50 3,7 мкм [88]. По мнению авторов, добавление пренильных групп обеспечивает более сильных гидрофобные взаимодействия с молекулой протеазы. Усилению ингибирующей активности, вероятно, способствовало и увеличение числа гидроксильных групп во флавоновой структуре [88]. Сходным действием, по-видимому, обладают и геранилированные флавоноиды (вид пренилированных соединений), у которых геранильный фрагмент присоединен к флавоноидной структуре в положении С10. Разработанная таким образом серия геранилированных флавоноидов, таких как томентин А, томентин B, томентин С, томентин D и томентин E обладали значительно более высокой угнетающей активностью в отношении PLpro SARS-CoV, чем исходные соединения [89].

Ряд исследований in vitro подтверждает высказанное выше предположение о том, что мы

133

РНК-матрицы путем включения в цепь новых нуклеотидов с визуализацией расширения продукции РНК. Применение байкалина и особенно байкалеина обусловило уменьшение образовавшихся продуктов РНК, что авторы расценили как подавление активности RdRp SARS- CoV-2 [69]. Поскольку оба соединения не являются аналогами нуклеозидов, которые RdRp встраивает в образующуюся РНК в ходе репликации, цитируемые авторы полагают, что наиболее вероятным механизмом ингибирования является связывание с RdRp в местах, отличных от активного сайта фермента.

Анализируя эксперименты in vitro, можно констатировать, что ряд флавоноидов способен нарушать проникновение коронавируса в клетку-хозяина путем связывания с АПФ 2, RBD S- белка SARS-CoV-2 или воздействия на активность этих структур. В хроматографическую колонку в качестве неподвижной фазы загружали культуру клеток HEK 293 с рекомбинантным АПФ 2 человека (ACEh) и пропускали через нее исследуемые растворы, содержащие тестируемые флавоноиды. Время удерживания на колонке флавонолов кверцетина (1 мг/мл) и изорамнетина (1 мг/мл) составило 6,5 и 5,4 мин соответственно, тогда как в колонке с отрицательным контролем (только силикагель) эти вещества не удерживались [93]. Подтверждением сродства кверцетина и изорамнетина с ACEh явилась определенная этими же исследователями с помощью технологии SPR константа равновесной диссоциации (KD), которая составила 5,92±0,92 и 2,51±0,68 мкм соответственно. Наконец, те же флавоноиды в концентрации 50 мкм на 47,70±0,72% ослабляли проникновение псевдотипированных вирусов, несущих на своей поверхности спайковый белок S SARS-CoV-2 в клетки HEK 293 [93]. Попутно заметим, что использование псевдотипированных вирусов на основе лентивирусной платформы, экспонирующей на своей поверхности гликопротеин S SARS-CoV-2, является адекватным альтернативным подходом, позволяющим за пределами лабораторий с уровнем биобезопасности BSL-3 и BSL-4 исследовать проникновение этих псевдовирусов в клетки HEK 293 [94,95]. В других in vitro экспериментах кверцетин, рутин и кверцетин-3-О-гликозид в концентрации 10 мкм на 42-48% ингибировали активность ACEh. При этом IC50 кверцетина составила 4,48 мкм [96]. При хроматографическом исследовании с использованием в неподвижной фазе клеток HEK 293T, экспрессирующих рецепторы АПФ 2, было зафиксировано удерживание в колонке флавоноидов ороксолина А, вогонина, скутелларина и необайкалина на 10,90; 5,46; 4,37 и 2,97 мин соответственно. А высокое связывание указанных флавоноидов подтвердил анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса [97]. Интересными представляются и эксперименты с использованием колориметрического анализа методом ELISA для обнаружения белка АПФ 2. Этот метод, основанный на связывании тестируемых соединений с комплексом спайковый белок S1 – АПФ 2, показал ингибирующее воздействие флаванона прополиса гесперетина с IC50 11,13 мкм, демонстрируя высокую

135