Глава 6
ФЛАВОНОИДЫ И КОАГУЛЯЦИОННЫЙ ГЕМОСТАЗ
Давно известно, что чрезмерная активность коагуляционного гемостаза обусловливает развитие тромботической болезни с повышением склонности к тромбообразованию и внутрисосудистому свертыванию крови (тромбофилии). Это состояние ассоциируется со многими сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ), в том числе с развитием артериального и венозного тромбоза, тромбоэмболии, ДВС-синдрома, атеросклероза, острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда, ишемического инсульта. Поэтому создание лекарственных препаратов, ослабляющих процесс неадекватно повышенного тромбообразования является актуальной проблемой. В этом контексте все большее внимание привлекают соединения растительного происхождения, обладающие антикоагулянтной и фибринолитической активностью. Они, как правило, оказывают мягкое воздействие на организм и зачастую лишены многих побочных эффектов, свойственных большинству синтетических антиагрегантов. Среди таких соединений растительного происхождения особого интереса заслуживают флавоноиды, обладающие, как выяснено, многогранным влиянием на организм человека.
Сегодня установлено, что окислительный стресс (ОС) различного происхождения, как и усиление липопероксидации, сопровождается выраженной гиперкоагуляцией с признаками тромбинемии, что создает угрозу внутрисосудистого свертывания крови [1-6]. Соответственно, применение антиоксидантов за счет угнетения перекисного окисления липидов снижает частоту тромботических осложнений [7,8]. На критическую роль ОС в процессе гемокоагуляции указывают недавние эксперименты, проведенные на нокаутных мышах. Эти животные, лишенные антиоксидантного белка параоксоназы 2, характеризовались не только активированным ОС, но и выраженной эндотелиальной дисфункцией. Соответственно, выраженные аномалии существенно ослаблялись при введении мышам антиоксиданта N- ацетилцистеина, а также антител к тканевому фактору свертывания крови [9].
Сходным образом обнаружено взаимовлияние воспалительного процесса и гемокоагуляции. Показано, например, что провоспалительные цитокины и другие воспалительные медиаторы активируют свертывание крови, равно как и активация сериновых протеаз, обеспечивающих коагуляционный каскад, активирует воспалительную реакцию путем воздействия на специфические рецепторы воспалительных клеток [10-13]. Поэтому вполне логичным выглядело предположение о возможности антикоагулянтного действия у флавоноидов,
96
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
обладающих выраженной антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Последовавшие экспериментальные исследования позволили подтвердить данное предположение [14-16].
Впоследние годы появилось значительное количество публикаций, касающихся антикоагулянтной активности различных растений, растительных экстрактов и отдельных соединений растительного происхождения, бОльшая часть которых принадлежит к классу флавоноидов [17]. В условиях in vitro и in vivo многие из протестированных соединений увеличивали показатели активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ), указывая на воздействие на внутренний и внешний пути свертывания крови [18,19].
Важнейшую роль в инициировании свертывания крови играет тканевой фактор (ТФ) или тканевой тромбопластин. ТФ – мембранный гликопротеин, являющийся рецептором фактора свертывания VIIa, экспрессирован в клетках адвентиции сосудов (но не в эндотелии) и в циркулирующих клетках крови. Однако в определенных патофизиологических условиях, сопровождающих сосудистое повреждение, гипертензию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, сахарный диабет, бактериальную и вирусную инфекцию, курение наблюдается резкое индуцирование экспрессии ТФ в эндотелиальных клетках и моноцитах. Индукторами экспрессии ТФ выступают тромбин, серотонин, гистамин, окисленные липиды, бактериальные липополисахариды (LPS), а также такие провоспалительные цитокины как интерлейкин-1β (ИЛ-1β), фактор некроза опухоли (TNF-α), некоторые фрагменты комплемента и др. Высокая тромбогенная активность ТФ обусловлена тем, что образовавшийся каталитический комплекс ТФ-VIIa в присутствии ионов Ca2+ активирует фактор свертывания X до Xa, обусловливая основной путь запуска коагуляционного каскада [20-22].
Вэкспериментах на эндотелиальных клетках пупочной вены и моноцитах человека, стимулированных LPS, ИЛ-1β или TNF-α, инкубирование с флавонолом кверцетином приводило к дозозависимому снижению активности ТФ [23]. Причем выявленный эффект развивался параллельно с существенным снижением экспрессии гена мРНК ТФ. Авторы выяснили, что снижение экспрессии гена ТФ было обусловлено угнетением активности фактора c-Rel/p65, принадлежащего к семейству ядерного транскрипционного фактора NF-κB и индуцирующего транскрипционную активацию ТФ [23]. Аналогичный эффект кверцетина подтвердился и другими исследователями в опытах с мононуклеарными клетками периферической крови [24]. В другой работе in vitro один из сульфатных эфиров кверцетина, выделенный из южноамериканского растения Flaveria bidentis, в концентрациях 1-500 мкм ингибировал экспрессию ТФ после инкубирования с моноцитами человека, предварительно активированными LPS [25]. Угнетение активности ТФ и его мРНК было зафиксировано и при
97
применении изофлавона генистеина на эндотелтальных клетках пупочной вены и аорты человека, стимулированных минимально окисленным липопротеином низкой плотности [26]. Обнаружилось, что в этих условиях генистеин уменьшал индуцированную активность ТФ до базальных значений, что было обусловлено снижением уровня его мРНК. При этом авторам удалось доказать, что эффект изофлавона не зависел от воздействия на эстрогеновые рецепторы, содержание оксида азота (NO) и ингибирование тирозинкиназы, а был скорее обусловлен инргибированием фосфорилирования ERK, члена семейства митоген-активируемых протеинкиназ MAPK [26]. В исследовании, проведенном китайскими учеными с использованием 12 флавоноидов, относящихся к подклассам флавонов, флавонолов, флаванолов и флавоноидных гликозидов, протестировали активность ТФ в моноцитах человека, стимулированных LPS [27]. Авторы попытались выявить химико-биологические ассоциации, определяющие способность флавоноидов ингибировать активность ТФ. Анализ показал наличие определенных закономерностей, способствующих ингибированию активности ТФ. Первая из них — наличие метокси-групп в положениях 3' и 4' кольца В. Так, соединение, представляющее собой триметиловый эфир флавона лютеолина и содержащее две группы OCH3, в указанных местах проявило в 100 и 50 раз бОльшую активность по сранению с соединениями, содержащими лишь одну метокси-группу. Цитируемые исследователи полагают, что наличие указанных групп в кольце В повышает липофильность молекул и способность взаимодействовать с мембранами клеток. С этим мнение согласны и другие исследователи [28]. Другая особенность состоит в присутствии гидроксильных заместителей в тех же положениях 3' и 4' кольца В флавонов. По крайней мере, соединение, содержавшее две такие группы в 300 раз более активно ингибировало активность ТФ в сравнении с флавоноидом, содержащим один такой заместитель. Интересно, что присутствие 3',4'- катехольной структуры в кольце В соответствует наличию антиоксидантной активности флавоноидных соединений, выявленной в других исследованиях [29,30]. Наконец, авторы приведенной выше работы [27] отметили, что дозозависимое подавление индукции ТФ, значительно выраженное у флавонолов кемпферола и кверцетина, возможно, обусловлено присутствием гидроксильной группы в положении 3 кольца С. В любом случае, подобные исследования должны быть продолжены, учитывая перспективу создания новых препаратов, способных повлиять на процесс свертывания крови.
Как уже отмечалось, важнейшим моментом первой фазы коагуляционного каскада является образование протромбиназного комплекса, включающего активный X фактор плазмы крови (FXa), активный V фактор плазмы крови (FVa) и ионы Ca2+. Как при внешнем, так и при внутреннем механизмах, активация X фактора происходит на матрицах, представляющих собой фосфолипидные осколки клеточных мембран, поврежденных тканей и форменных элементов
98
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
крови. Протромбиназный комплекс обеспечивает превращение протромбина в тромбин. Причем одна активная молекула FXa генерирует более 1 000 молекул тромбина. Поэтому FXa является перспективной мишенью для создания современных антикоагулянтов [31]. При этом существует точка зрения о преимуществах селективного ингибирования FXa перед угнетением активности тромбина. Авторы этого мнения обосновывают его тем, что ингибиторы FXa, предотвращая конверсию протромбина в тромбин, не оказывают влияния на ранее образовавшийся тромбин, поддерживая базальный уровень его активности, необходимый для обеспечения первичного гемостаза и уменьшая тем самым вероятность осложнений в виде повышенной кровоточивости [32].
Пилотные исследования, проведенные в начале 2000-ых годов, касались создания полусинтетических сульфатированных соединений на основе молекул флавоноидов. Оказалось, что такие соединения существенно угнетали активность FXa, что авторы связывают с их способностью повышать активность антитромбина III (АШ), основного ингибитора фактора Xa и тромбина [33,34]. Именно так, как известно, действует классический антикоагулянт гепарин, представляющий собой сульфатированный пентасахарид. Правда, гепарин повышает активность антитромбина в 300 раз, тогда как вновь созданные молекулы – лишь в 10 раз. Цитируемые авторы объясняют такую разницу тем, что сульфатированные флавоноиды взаимодействуют лишь с одним из двух мест связывания в молекуле антитромбина, тогда как гепарин – с обоими [35]. В другом исследовании, посвященном обсуждаемой проблеме, был синтезирован ряд полисульфатированных флавоноидных структур с изучением их антикоагулянтной активности in vitro и in vivo. Оказалось, что полученные соединения эффективно блокировали процесс тромбообразования в отличие от соответствующих агликонов [36]. Тромбоэластография подтвердила антикоагулянтные свойства протестированных полисульфатированных флавоноидов. Выяснилось, что созданные 3-О-рутинозиды прямо ингибировали FXa, тогда как 7-O-рутинозиды угнетали активность того же фактора посредством активации ATIII. Полученные результаты побудили польских исследователей целенаправленно провести скрининговое изучение 20 полифенольных соединений относительно активности фактора Xa [31]. Из этих проверенных соединений 4 вещества, принадлежащие к классу флавоноидов (процианидин В2, цианидин, кверцетин и силибин), дозозависимо ингибировали FXa. Проведенный авторами биоинформационный анализ с использованием метода молекулярного докинга позволил предположить, что перечисленные флавоноиды связываются с аминокислотными остатками в карманах S1-S4 структуры FXa, блокируя доступ к ней молекулы субстрата. При этом было, например, показано, что кольцо А в молекулах цианидина и кверцетина формирует солевой мостик с остатком Asp189, локализованным в кармане S1, а кольцо В этих флавоноидов взаимодействует с карманом S2.
99
Гидроксильные группы В-кольца процианидина В2 взаимодействуют с остатками Asp189 и Tyr228 кармана S1, в то время как гидроксильные группы В-кольца второй субъединицы этого флавоноида взаимодействуют с карманом S4, а лигандная единица локализуется в кармане S1, взаимодействуя с остатком Tyr228 [31]. В последние годы благодаря усилиям в основном корейских исследователей появились свидетельства того, что такие флавоноиды как лютеолин, кверцетин, изокверцетин, рутин, кемпферол, гиперозид, изорамнетин, ороксилин А, пеларгонидин, байкалин, выделенные из различных растений, прямо ингибируют образование и активность как фактора Xa, так и тромбина [37-44].
Сериновая протеаза тромбин играет решающую роль в процессе свертывания крови, обусловливая вторую фазу коагуляции, способствуя превращению растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, основу образующегося сгустка, и обеспечивая его стабилизацию. Поэтому образование тромбина и его активность являются центральным звеном гемостаза и регулируют коагуляционную активность крови. Вот почему интерес к действию флавоноидов, у которых обнаружена выраженная антитромбиновая активность, в последние годы значительно вырос. Не так давно китайскими исследователями проведено скрининговое определение антитромбиновой активности у 30 флавоноидов: 16 флавонолов, 5 флавонов, 5 флаванонов, 2 бифлавонов, 1 изофлавоноида и 1 катехина [45]. У 11 флавоноидов в эксперименте на кроликах было выявлено дозозависимое угнетение активности тромбина. Предварительный анализ химико-биологических закономерностей (SARs) показал, что гидроксильная группа в положении 3 кольца С играет ключевую роль в обеспечении обнаруженной активности. Кроме того, ингибирующая тромбин активность
прямо зависит от количества OH-групп в кольце В. Было также найдено, что присутствие двойных связей между атомами углерода 2 и 3 и в положении 4 кольца С, по-видимому, имеет важное значение в обеспечении отмеченной активности. Наряду с этим, авторы полагают, что присутствие гликозидных остатков существенно снижает способность подавлять активность тромбина. В итоге, наибольшую активность проявили мирицетин и кверцетин, а по степени ингибирования тромбина изученные соединения распределились следующим образом: мирицетин > кверцетин > кемпферол > галангин [45]. Полученные данные позволили цитируемым авторам провести докинг-анализ двух наиболее активных флавонолов. Для этого в качестве рецепторных моделей для докинг-экспериментов были использованы данные рентгено-кристаллографической структуры тромбина из банка данных трехмерных структур (PDB) в сравнении с 2-(2-хлоро-6-флуорофенил) ацетамидом, известным ингибитором этой сериновой протеазы. Анализ показал, что мирицетин и кверцетин взаимодействовали в молекуле тромбина в основном с карманом S3 (препарат сравнения — со всеми тремя карманами S1, S2, S3), образуя по 3 водородные связи с активными аминокислотными остатками
100
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
(препарат сравнения — 8 водородных связей). При этом мирицетин взаимодействовал с девятью активными аминокислотными остатками, а кверцетин — с шестью [45]. Сходные результаты докинг-анализа были продемонстрированы и в других исследованиях [46,47]. В еще более ранней работе in vitro инкубирование 0,25 нМ тромбина с нарастающими концентрациями флавоноидов кверцетина, рутина (кверцетин-3-рутинозида), лютеолина, эпикатехина и катехина показало обратимое ингибирование этого фактора свертывания крови [48]. Проведенный авторами докинг-анализ привел к модели, согласно которой в комплексе тромбин-кверцетин образуется критическая водородная связь между остатком His57 в каталитическом месте тромбина и кислородом в положении 3 молекулы флавоноида с ее включением в узкий гидрофильный регион каталитического кармана тромбина. Это взаимодействие обеспечивало ингибирование амидолитической активности тромбина [48]. Логическим продолжением приведенных выше исследований явилась работа польских авторов, в которой было протестировано влияние 20 полифенольных соединений на активность тромбина. Из них 6 флавоноидов, принадлежащие к флаванолам, флавонолам и антоцианидинам (цианидин, кверцетин, силибин, цианин, (+)-катехин и (-)-эпикатехин) проявили существенное угнетающее воздействие в отношении амидолитической активности тромбина [49]. И лишь 3 из этих 6 флавоноидов (цианидин, кверцетин и силибин) ингибировали его протеолитическую активность, дозозависимо снижая максимальную скорость полимеризации фибриногена, индуцируемую тромбином. Анализ собственных и предыдущих исследований, проведенный авторами, позволил им прийти к следующему заключению. Ряд флавоноидов продемонстрировал конкурентную природу ингибирования тромбина человека. Очевидно, эти соединения имитируют структуру субстрата (фибриногена) и обратимо взаимодействуют со свободной формой энзима (тромбина) в конкуренции с субстратом за активное место энзима. Таким образом, когда флавоноид занимает активный центр тромбина он предупреждает связывание фибриногена и предотвращает образование фибрина [49]. Способность флавоноидов угнтать активность тромбина была продемонстрирована и в ряде других исследований [50-52].
Выяснилось также, что некоторые растительные экстракты и отдельные флавоноиды наряду с антикоагулянтной обладают и фибринолитической активностью. Так, экстракт из коры корней пиона Paeonia lutea при введении животным не только в 1,4 раза увеличивал АЧТВ, но в 1,6 раза повышал суммарную фибринолитическую активность и в 2 раза – активность тканевого активатора профибринолизина (t-PA) [53,54]. А два флавоноида из растения Oenanthe javanica обеспечивали значительное пролонгирование АЧТВ и ПВ, а также ингибирование активности тромбина и FXa в эндотелиальных клетках пупочной вены человека, активированных фактором некроза опухоли TNF-α [37]. Кроме того, 3-О-галактозид изорамнетина существенно снижал
101
отношение ингибитора активатора профибринолизина (PAI-1) к t-PA, что указывает на профибринолитическую активность соединения. При этом более выраженное антикоагулянтное действие указанного соединения в сравнении с другим флавоноидом гиперозидом авторы связывают с присутствием в молекуле первого флавоноида метокси-группы [37]. Сходная активность была обнаружена в этой же лаборатории у антоцианидина пеларгонидина и у основных компонентов Scutellaria baicalensis флавоноидов ороксилина А и байкалина [38-40]. Кроме того, было показано, что пеларгонидин угнетает агрегацию тромбоцитов [39]. Полученные результаты позволили приведенным авторам сформулировать основные антикоагулянтный и профибринолитический механизмы изученных соединений. Они включают: 1. Ингибирование внутреннего и внешнего путей свертывания крови. 2. Подавление продукции и активности FXa. 3. Угнетение полимеризации фибрина. 4. Снижение соотношения
PAI-1/t-PA.
Отдельно следует отметить гипокоагуляционную активность изофлавонов. Особенность этих флавоноидов в значительной степени обусловлена их способностью взаимодействовать с эстрогеновыми рецепторами в качестве их агонистов/антагонистов [55]. В связи с этим их называют фитоэстрогенами. По этой причине соевые пищевые продукты, а также содержащиеся в них изофлавоноиды рекомендуется применять при нарушениях менструального цикла и в качестве средств заместительной гормональной терапии женщинами в постменопаузный период [56-59]. Сегодня известно, что менее 20% японок, которые, как известно, широко применяют соевые продукты, жалуются на симптомы, сопутствующие менопаузе, в то время как у европейских женщин этот показатель находится на уровне 80% [60]. Выяснилось также, что потребление соевых пищевых продуктов, как и отдельных фитоэстрогенов, снижает риск развития целого ряда сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе за счет ингибирования свертывания крови и развития атеросклероза [61,62]. Это и обусловило интерес к изофлавонам как к средствам, благоприятно влияющим на тромбообразование. В экспериментах с применением генистеина выяснилось, что этот изофлавон угнетал тромбоцитарную окклюзию бедренной артерии мышей [63]. А в спциальном исследовании, проведенном томскими фармакологами, было установлено, что растительные экстракты, содержащие смесь изофлавоноидов даидзеина, генистеина, биоханина, формононетина и ононина, в экспериментах на овариоэктомированных крысах значительно угнетали развитие процесса внутрисосудистого тромообразования, индуцированного аппликацией на сонную артерию раствора хлорида железа [64,65]. В наших экспериментах сухой экстракт из Maackia amurensis, содержащий комплекс изофлавонов, идентифицированный сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения РАН, обладал высокой антикоагулянтной
102
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/