Предполагаемые механизмы антитромбоцитарного действия флавоноидов

было показано, что катехин, мирицетин, кверцетин, апигенин и морин в отмытых тромбоцитах человека в значительной степени (на 48-95%) ингибировали АТ, угнетая в микромолярных концентрациях образование TxA2 [71]. К возможностям последовательного воздействия на звенья этого пути следует отнести угнетение самОй PLA2, ингибирование активности циклооксигеназы (ЦОГ) и липоксигеназы (ЛОГ), ферментов, гидролизующих АК, тромбоксансинтазы, обеспечивающей образование тромбоксанов (TxA2 и TxB2), а также блокирование тромбоксановых рецепторов. Несмотря на то, что имеются единичные сведения, полученные в экспериментах in vitro, согласно которым некоторые флавоноиды (рутин, кверцетин, бифлавон) способны прямо угнетать PLA2 [72-75], значительно больше данных указывает на то, что ингибирующее влияние локализовано ниже по течению. Так, при тестировании фармакологического действия флавоноидов артемизии эупатилина и джацеосидина было зафиксировано снижение АТ, образования TxA2 и серотонина, индуцированные арахидоновой кислотой, но не коллагеном или АДФ в крови здоровых добровольцев [76]. А еще до этого было показано, что использование катехинов зеленого чая и богатого кверцетином водного экстракта лука угнетало в тромбоцитах индуцируемое высвобождение АК [77,78]. Гораздо больше результатов относительно угнетающего влияния флавоноидов на события в пределах рассматриваемого каскада касается активности ЦОГ, тромбоксансинтазы, превращающей простагландин H2 в тромбоксаны, и тромбоксановых рецепторов. В недавнем исследовании детальный анализ действия 29 флавоноидов показал, что лишь изофлавоны генистеин и даидзеин в значительной степени угнетали активность ЦОГ-1, превосходя по силе известный ингибитор этого фермента ацетилсалициловую кислоту, при использовании овечьего энзима и несколько уступая ему в тромбоцитах человека. БОльшая же часть протестированных соединений действовала как антагонисты тромбоксановых рецепторов [32]. При этом лишь три флавоноида проявили угнетающий эффект в отношении тромбоксансинтазы, причем в очень высоких, клинически не достигаемых концентрациях. И хотя существуют отдельные предположения о возможной способности флавоноидов подавлять активность тромбоксансинтазы [78,79], в существенно бОльшем количестве исследований традиционно полагали, что нарушение синтеза TxA2 обусловлено, скорее, угнетением обеспечиваемого ЦОГ гидролиза АК. Такой механизм был первоначально предложен R.Z.Mower и соавторами [80], которые обнаружили, что флавоны угнетали в тромбоцитах активированный АК сигнальный каскад. Эти данные впоследствии подтвердились многочисленными исследованиями [32,35,56,66,81,82]. Что касается более поздних данных, они убедительно говорят о способности многих флавоноидов прямо блокировать тромбоксановые рецепторы. Так, в опытах с изучением биологической активности выяснилось, что флавоны апигенин, лютеолин, кверцетин, а также изофлавон генистеин в диапазоне микромолярных

79

образования IP3 и DAG, что косвенно указывает на снижение активности фосфолипазы C. Об этом же говорит и уменьшение содержания в тромбоцитах фосфатидилинозитол (4,5)- дифосфата как субстрата для воздействия PLCγ2 при применении кверцетина и катехина [98].

Хорошо известна роль циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ в уменьшении внутриклеточного содержания Ca2+, который загоняется в места своего хранения (эндоплазматический ретикулум) или изгоняется из клетки соответственно. Поэтому увеличение содержания цАМФ и цГМФ в тромбоцитах существенно ослабляет их функциональную активность, в том числе и агрегацию. Существует два принципиальных пути увеличения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов: увеличение активности аденилатциклазы (АС) и гуанилатциклазы (GC) и деградация фосфодиэстераз, ферментов, метаболизирующих цАМФ и цГМФ. Исходя из этого, повышение уровня циклических нуклеотидов в тромбоцитах рассматривается как один из значимых механизмов ингибирования активности этих клеток. Результаты, полученные при изучении влияния флавоноидов на уровень циклических нуклеотидов, однако, являются противоречивыми, что ставит их под сомнение как основную мишень антитромбоцитарного эффекта этих полифенолов. Первые сведения относительно увеличения содержания цАМФ и цГМФ в тромбоцитах появились на рубеже 80-ых годов. В экспериментах с использованием кверцетина у людей было зафиксировано ингибирование АТ, что, по предположению авторов, было обусловлено повышением внутриклеточной концентрации цАМФ [99]. В другой работе аналогичный эффект α-нафтофлавона был связан с ростом содержания в тромбоцитах цГМФ [100]. Подобный эффект, обусловленный увеличением обоих циклических нуклеотидов, наблюдался при использовании экстрактов чеснока, содержащих значительное количество аллицина [101,102]. Сходным образом фиксировалось увеличение концентрации цАМФ в тромбоцитах и в результате применения кверцетина и EGCG [103,104]. Относительно ингибирования активности фосфодиэстераз, приводящего к накоплению в тромбоцитах циклических нуклеотидов, отметим, что еще в 1979 году было высказано мнение, согласно которому флавоноиды являются селективными ингибиторами этих ферментов [105,106]. Это согласуется с предположением о том, что дигидрокверцетин увеличивает содержание цАМФ и цГМФ в нативных и активированных тромбоцитах за счет ингибирования фосфодиэстераз [107]. Способность блокировать различные формы фосфодиэстераз в тромбоцитах была выявлена у диосметина, биоканина А, апигенина, мирицетина [56].

Напомним, что ключевым фактором активации тромбоцитов является рост концентрации ионизированного кальция в цитоплазме. Увеличение свободного внутриклеточного Ca2+ в тромбоцитах необходимо для реорганизации цитоскелета, ведущей к изменению формы, дегрануляции, стимуляции PLA2, PKC, модулированию активации интегринов, обеспечивает

81

ряд синтетических флавоноидных дериватов в концентрации 10 мкМ вызывали 50%-ное ингибирование индуцируемой тромбином АТ [109]. При этом авторами было предположено, что наблюдавшийся эффект обусловлен блокадой кальциевых каналов SOCC, обеспечивающих вход Ca2+ в тромбоциты, а не нарушением фосфорилирования тирозинкиназ или стимулированием образования NO [109].

Учитывая значительное количество различных киназ, обеспечивающих процесс внутриклеточного сигнализирования в ходе агрегации тромбоцитов, естественным выглядит предположение о том, что антитромбоцитарная активность флавоноидов может зависеть от их способности влиять на активность этих ферментов. По современным представлениям практически все, как “outside-in”, так и “ in-outside” сигнальные пути, индуцируемые активаторами АТ, осуществляются при участии тирозинкиназ (Src, Fyn, Lyn, Syk), серин/треониновых протеинкиназ (ERK1/2, JNK, p38), киназы легких цепей миозина (MLCK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Причем важную роль в процессе АТ играет не только активность тромбоцитарных, но и киназ гладкой мускулатуры сосудов и клеток эндотелия. В имеющемся литературном массиве можно отыскать сведения об ингибирующем воздействии флавоноидов на активность практически всех перечисленных киназ. Давно показано, например, что изофлавон генистеин обладает антитирозинкиназной активностью в тромбоцитах [66,82]. А структурно различающиеся флавоноиды кверцетин, апигенин и катехин, как выяснилось, способны ингибировать в тромбоцитах тирозинкиназы Fyn, Lyn, Syk, активность адаптерного протеина LAT, а также PI3K и PLCγ2, прерывая таким образом сигнальный каскад, индуцируемый коллагеном, что приводит к угнетению АТ [5,115]. Рентгенокристаллографический анализ киназно-флавоноидных структур подтвердил, что флавоноидные кольцевые структуры и их гидроксильные заместители вовлечены в связывание этих соединений с киназами семейства Src, серин/треониновыми киназами и PI3Kγ [5]. Cпособность ингибировать MAPK-киназы выявлена у EGCG, апигенина, лютеолина, кемпферола, генистеина [82,116,117]. Под влиянием лоуреирина А, нобилетина, и кемпферола недавно обнаружено угнетение сигнального пути PI3K/PKB(Akt) 9,117,118][. Особого внимания заслуживает действие кверцетина, по-видимому, обладающего политаргетным эффектом в отношении АТ. По крайней мере, при его использовании обнаружено подавление активности сигнальных каскадов, в которых принимают участие тирозинкиназы, серин/треониновые и MAPK-киназы, а также PI3K/PKB/Akt сигнализирование [35,67,82,119]. Имеются сведения относительно ингибирующего влияния флавоноидов в отношении PKC, которое было обнаружено как в тромбоцитах, так и в других клетках [67]. А в недавнем исследовании было показано, что скутелларин наряду со снижением мобилизации внутриклеточного Ca2+ и уровня цАМФ угнетал активность PKC, которая, по мнению авторов, является первичной мишенью этого

83

Это, вероятно, обусловлено тем, что не все известные внутриклеточные сигнальные каскады в тромбоцитах ассоциированы с ОС и образованием АФК [67,124].

Установлено, что среди всех стимуляторов тромбогенеза наиболее мощным является тромбин, который благодаря стимуляции PAR-1 и PAR-4 тромбиновых рецепторов на мембране тромбоцитов индуцирует полный каскад реакций, включая изменение формы тромбоцитов, секрецию их гранул, образование TxA2, мобилизацию Ca2+ и агрегацию [60,63]. Не вызывает удивления поэтому, что нивелирование эффектов тормбина приводит к ослаблению АТ. Касаясь действия флавоноидов, отметим, что в ряде работ зарегистрировано такое действие этих полифенольных соединений. Правда, локализация эффекта по ходу индуцируемых тромбином внутриклеточных сигнальных событий пока точно не выяснена. Попытка установить возможность взаимодействия флавоноидов с PAR-1 и PAR-4 рецепторами на мембранах тромбоцитов показала отсутствие у кверцетина, апигенина и генистеина прямого блокирующего эффекта [111]. Повторив сказанное выше, отметим, что, по мнению данных авторов, антитромобоцитарная активность в этом случае, вероятно, обусловлена ингибированием активности ферментов, участвующих во внутриклеточном сигнализировании или процессах транспортировки Ca2+. Относительно недавно была предложена и иная возможность. В экспериментах in vitro было показано, что кверцетин, рутин, лютеолин, силибин, цианидин, эпикатехин и катехин угнетали амидолитическую, а цианидин, кверцетин и силибин — протеолитическую активность тромбина [138,139]. Моделирование взаимодействия тромбина с флавоноидами с помощью докинг-анализа показало способность молекулы флавоноида встраиваться в каталитический карман тромбина и, взаимодействуя с каталитической триадой протеазы, конкурентно блокировать ее активность [138-140]. Наличие ингибирующего эффекта в отношении амидолитической активности тромбина было выявлено и у других полифенольных соединений растительного происхождения [58,141-144]. Кроме того, имеются данные о способности изофлавонов снижать активацию тромбоцитов и ингибировать активность тромбина, способствующую ферментативному превращению фибриногена в фибрин

[87,131,145].

Единичные исследования, проведенные in vitro, указывают на возможность прямого воздействия флавоноидов на АДФ-чувствительные рецепторы [38]. Показано, что протестированные флавоны, флавонолы и флаваноны с разной степенью активности прямо блокировали A1 и A3 аденозиновые рецепторы [146]. Впоследствии в этой же лаборатории приведенные данные были подтверждены с использованием анализа конкурентного связывания радиолиганда [147]. Имеются также сведения о способности отдельных флавоноидов ослаблять взаимодействие интегрина αIIb/β3 (GPIIb/IIIa) с фибриногеном и за счет этого угнетать АТ [148]. А недавно выяснено, что ксантогумол, основной флавоноид, выделенный из шишек хмеля,

85

образование тромбов в бедренной артерии [55]. В опытах на крысах введение флавоноидов гесперидина, флавицина, кверцитина, диосмина в течение месяца в дозе 100 мг/кг приводило к параллельному ослаблению агрегации тромбоцитов и эндотелий протективному эффекту, что было обусловлено увеличением продукции NO [154]. В другой работе те же флавоноиды в той же дозе способствовали восстановлению антитромбинового потенциала эндотелия у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. При этом было обнаружено снижение в крови уровня фактора Виллебранда, а наибольшим эффектом обладал флавицин [155]. По сути, аналогичный результат был позднее получен при использовании катехина и цианидин-3-О-β-гликозида у мышей и крыс с сахарным диабетом [156-158]. Кроме того, установлено, что многие флавоноиды параллельно индуцируют зависимую от эндотелия вазодилатацию [43,55,153,159]. По всей вероятности, наблюдавшийся эффект флавоноидов был обусловлен повышенным образованием NO. А это, в свою очередь, является, скорее всего, следствием активирования флавоноидами NOS, что и было зафиксировано в ряде исследований [30,33,43,58,153,155,160].

Не исключено, что биологическая активность флавоноидов, в том числе их влияние на функцию тромбоцитов, зависит от взаимодействия с мембранами этих клеток. Это позволяет флавоноидам интегрироваться в мембраны тромбоцитов с последующим влиянием на процессы внутриклеточного сигнализирования. Различные эксперименты показали, что активность флавоноидов в значительной степени ограничена полярным регионом липидного бислоя мембран, что, в свою очередь, обусловлено степенью липофильности молекулы [161]. В экспериментах с использованием культуры клеточной линии Caco-2 было показано, что кверцетин, кемпферол и лютеолин имели высокий аффинитет к мембранам липосом [162]. При этом выяснилось, что скорость трансмембранного транспорта зависела от степени гидроксилирования молекулы флавоноида. Кроме того, флуоресцентные исследования продемонстрировали, что ряд флавоноидов (нарингенин, рутин, генистеин, генистин, биоханин А, катехины), как и их метаболитов, значительно снижали текучесть мембран [163]. Снижение текучести мембран под влиянием флавоноидов было выявлено и другими авторами [164-167]. Такой эффект, несомненно, способен снизить функциональную активность тромбоцитов. В этой связи отметим точку зрения M.Bojić и соавторов [2019], которые полагают, что поскольку практически все изученные флавоноиды проявляют антитромбоцитарную активность в отношении агрегации, индуцируемой АДФ, им, скорее всего, свойствен единый универсальный механизм, обусловленный воздействием на мембраны тромбоцитов. Большинство флавоноидов являются высоко липофильными соединениями, способными стабилизировать мембраны тромбоцитов, воздействуя на их липидный бислой [69].

Как уже упоминалось, в результате активирования возникает изменение цитоскелета тромбоцитов, ведущее к трансформации их формы и влияющее на процессы внутриклеточного

87