3 курс / Фармакология / ФАРМАКОЛОГИЯ_ПРЕПАРАТОВ_НА_ОСНОВЕ_ПРИРОДНЫХ_АЛЮМОСИЛИКАТОВ_И_ИХ

Алгоритм исследований

Разработка препаратов на основе матрицы природных алюмосиликатов

Определение минерального состава и уровня тяжелых металлов, изучение физико-химических свойств

Фармако-токсикологическая оценка

– коррекции минерального обмена;– метаболических нарушениях функциипечени

Экономическая эффективность

Производственные испытания, разработка наставлений по применению

71

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Лабораторные животные содержались в условиях, соответствующих санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспери-

ментально-биологических клиник (вивариев), в помещениях с температурой

22–24º С, в клетках типового типа на деревянно-стружечной подстилке, с от-

носительной влажностью воздуха 40–50 %, при естественном световом ре-

жимесогласно предъявляемым требованиям по содержанию лабораторных животных (методические рекомендации по содержанию лабораторных жи-

вотных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведе-

ний, РД-АПК 3.10.07.02-09) и правил лабораторной практики при проведе-

нии доклинических исследований (ГОСТ 351000.3-964100.4-96).

Изучение токсикологических свойств препаратов проводили на ин-

тактных крысах (нелинейных), мышах, кроликах, поросятах и цыплятах-

бройлерах. В токсикологических опытах использовали здоровых половозре-

лых животных обоих полов, одинакового возраста и массы.

Исследования острой и хронической токсичности препаратов проводи-

ли согласно существующим методикам и нормативным документам: «Мето-

ды определения токсичности и опасности химических веществ (токсикомет-

рия)» (под редакцией Саноцкого И.В., 1970); «Научно-методологические ас-

пекты исследования токсических свойств фармакологических лекарственных средств для животных (Смирнов А.М., Дорожкин В.И., 2008); «Методиче-

ские указания по токсико-экологической оценке лекарственных средств,

применяемых в ветеринарии» (Всесоюзный НИИ незаразных болезней жи-

вотных, Воронеж, 1988).

Определение острой токсичности препаратов осуществляли по методу Г.Н. Першина (1950) и методу Deiсhmann и Le Blank (1943) на белых мышах,

белых крысах и кроликахпутем однократного внутрижелудочного введения в

дозах, многократно превышающих лечебные и профилактические с целью установления (LD50 и LD100). Исследуемые препараты по степени опасности классифицировали согласно ГОСТу 12-1-007-76.

72

Показателями определения острой токсичности служили: внешний вид животных, состояние кожного покрова, поведение (возбуждение или угнете-

ние, подвижность, изменение походки, реакции на внешние раздражения,

выделения из глаз, рта, мышечные подергивания, тремор, судороги, парали-

чи, парезы и т.д.), картина интоксикации, количество погибших и выживших животных.

Параметры субхронической и хронической токсичности препаратов изучали по общепринятым методикам на белых крысах, поросятах и цыпля-

тах-бройлерах. Препараты задавались внутрь индивидуально ежедневно натощак в течение 28 (субхроническая токсичность) и 60-ти (хроническая токсичность) дней по непрерывной схеме в трех дозах, руководствуясь ре-

зультатами, полученными при исследовании острой токсичности.

При ежедневных наблюдениях за животными учитывалось общее со-

стояние и поведение (аппетит, возбуждение или угнетение), изменения реак-

ций на внешние раздражители и функций органов пищеварения и мочеотде-

ления, динамика прироста массы тела. Отмечались клинические симптомы отравления, количество заболевших и павших животных.

Функциональное состояние мочевыделительной системы определяли по диурезу и клиническому анализу мочи. Моча отбиралась до кормления в утрен-

ние часы в момент свободного мочеиспускания. В моче определяли цвет, кон-

систенцию, запах, концентрацию водных ионов, удельный вес, содержание бел-

ка, углеводов, гемоглобина, желчных пигментов при помощи специальных по-

лосок для биохимического анализа мочи фирмы DEKA PHAN Leuco.

Влияние на функцию пищеварительной системы оценивали по физико-

химическим исследованиям фекалий животных и помета птицы, в которых определяли консистенцию, цвет, запах, наличие примесей, растительную клет-

чатку, жировые капли и крахмал, нейтральный жир, переваримую клетчатки,

эритроциты, эпителиальные клетки, лейкоциты, билирубин и скрытую кровь.

73

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Местно-раздражающее действие веществ определяли методом накож-

ных аппликаций и конъюнктивальных проб согласно «Методическим указа-

ниям, по токсикологической оценке, новых препаратов для лечения и профи-

лактики незаразных болезней животных» (1987). О наличии у препаратов раз-

дражающих свойств судили по появлению на месте аппликации гиперемии,

отека, расчесов, появлению корок и трещин. При исследовании местного дей-

ствия на слизистые глаз обращали внимание на появление гиперемии, отечно-

сти склеры и роговицы, ширину зрачка (миоз, мидриаз) и состояние век.

Выявление отдаленных последствий проводили общепринятыми мето-

дами, оценивая влияние препаратов на эмбриональное развитие и генератив-

ную функцию самок белых крыс, а также физиологическое состояние рож-

денного от них потомства. За молодняком, полученным от крыс, используе-

мых в опытах, вели наблюдения. Показателями общего постнатального раз-

вития служили динамика массы тела крысят, время открытия глаз, появление шерсти, двигательная активность, способность координации движений и вы-

живаемость.

Изучение влияния препаратов на макро- и микроструктуры внутренних органов проводилось в ходе экспериментов по их длительному применению лабораторным и сельскохозяйственным животным. В качестве объекта при гистологическом исследовании использовались кусочки сердца, легких, пе-

чени, почек, селезенки, желудка, кишечника, которые фиксировались в 10%-

ном растворе нейтрального формалина. После фиксации органы заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4-6 мкм, окрашивали гематоксилин-

эозином и микроскопировали. Исследования проводились под микроскопом МС 300 (страна-производитель Австрия), при увеличении х5, х10. Критерия-

ми оценки гистологических изменений являлось состояние ткани органа,

стромы, сосудов, нервов, наличие дистрофических и воспалительных процес-

сов, степень однородности ткани и др.

74

Ветеринарно-санитарную экспертизу туш и внутренних органов после применения препаратов проводили на кроликах, свиньях и птице в установ-

ленном порядке, которая включала в себя органолептическую и дегустацион-

ную оценку мяса и жира с обязательными токсикологическим, бактериологи-

ческим и физико-химическим исследованиями согласно ГОСТ 7269-79,

ГОСТ 23392-78, ГОСТ Р 53221-2008, ГОСТ 31470-2012.

Изучение фармакотерапевтического действия препаратов проводи-

лось на сельскохозяйственных животных и птице для оценки фармакодина-

мических эффектов, и лечебно-профилактической эффективности. Группы животных комплектовали по принципу аналогов, с учетом породы, пола,

массы, возраста, условий содержания и кормления. Количество животных в группах определяли целесообразностью объективной оценки полученных ре-

зультатов и их статистической достоверности. Кормление осуществлялось в соответствии с общепринятыми нормами и рационами с учетом технологиче-

ских и физиологических особенностей для разных видов сельскохозяйствен-

ных животных и птицы.

Фармакодинамику препаратов определяли по их влиянию на показате-

ли белкового, углеводного, липидного, минерального обмена веществ, состо-

яние органов кроветворения (эритро- и гемопоэз), на иммунологические по-

казатели и нормализации физиологических функций органов и систем.

За всеми животными в течение периода назначения препаратов еже-

дневно проводились клинические наблюдения, учитывалось общее состоя-

ние, аппетит, продуктивность, заболеваемость и сохранность. Показателем продуктивности служили приросты массы тела животных.

Потребление корма, а также кормов с добавлением исследуемых препа-

ратов в каждой группе животных и птицы рассчитывали ежедневно, начиная с первого дня эксперимента и в дальнейшем в течение всего периода опыта. Со-

гласно полученным количественным данным рассчитывали затраты кормов на одну голову и 1 кг прироста массы тела животного и птицы (конверсия).

75

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Терапевтические свойства препаратов изучали на больных животных,

профилактические – на клинически здоровых, после предварительного об-

следования, включающего осмотр, термометрию и лабораторные исследова-

ния крови. В ходе экспериментов оценивали общее состояние, упитанность,

отставание в росте и развитии.

Лечебно-профилактическое действие препаратов изучали при анемии, гипо-

купрозе и гипотрофии поросят, заболеваниях желудочно-кишечного тракта (дис-

пепсия, гастроэнтерит, колибактериоз) молодняка сельскохозяйственных живот-

ных (поросята, телята), микотоксикозах, метаболических нарушениях функции печени, при коррекции минерального обмена, вторичных иммунодефицитах.

Влияние на заживление ран изучали на белых крысах и поросятах при внутреннем и наружном применении препарата.

Критерием эффективности препаратов служили результаты комплекс-

ных клинических, биохимических, гематологических методов исследования,

а также контрольного взвешивания. Лечебно-профилактическую эффектив-

ность определяли в сравнении с широко применяемыми в данных показаниях препаратами и отрицательным контролем.

Трупы павших и убитых животных подвергали патологоанатомическо-

му вскрытию. Вскрытие проводили общепринятыми методами. С помощью штангенциркуля и электронных аналитических весов «Acculab» определяли линейные размеры и массы паренхиматозных органов.

Послеубойный ветеринарно-санитарный осмотр тушек животных выпол-

няли общепринятыми методами, руководствуясь «Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мяс-

ных продуктов» (1988), «Правилами ветеринарно-санитарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мясных продуктов» (2001).

Описание структуры опытов, а также специфики проводимых экспери-

ментов в зависимости от целей и задач исследований представлено в соответ-

ствующих главах диссертационной работы.

76

Для гематологических исследований кровь у поросят получали из со-

судов уха и хвоста, у телят – из яремной вены, цыплят-бройлеров – подкры-

ловой вены, у кроликов – из вены Сафена, у крыс кровь отбиралась при дека-

питации (из сердца).

Во всех случаях кровь бралась с соблюдением правил асептики и антисеп-

тики, место венепункции выстригали и дезинфицировали 70%-ным раствором этилового спирта. Для получения плазмы использовались пробирки с антикоагу-

лянтом (ЭДТА), сыворотки – пробирки с активатором свертывания крови.

Морфологические исследования крови. Исследования проводили на ве-

теринарном гематологическом анализаторе ABACUS (Diatron, Австрия), ско-

рость оседания эритроцитов (СОЭ) определяли микрометодом Панченкова

(Кондрахин И.П., Таланов Г.А., Пак В.В., 2003)

Биохимические исследования крови. Основные биохимические показате-

ли определяли на автоматическом химическом анализаторе – Vitalab Selectra

Junior с версией программного обеспечения 1.0. (открытая система для прове-

дения фотометрических тестов, изготовитель Vital Scientific N. V. Netherlands)

с использование реактивов фирмы ELITech Clinical Systems (Франция) и

Аnalyticon biotechnologies AG (Германия); микроэлементы – методом атомно-

адсорбционной спектрометрии на приборе «Квант-2» (Россия).

В сыворотке крови определяли: концентрацию общего белка; содержа-

ние общего и прямого билирубина; активность аланинаминотрансферазы

(АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ);

содержание мочевины и креатинина; холестерин и триглицериды; содержа-

ние микроэлементов (Ca, P, Zn, Cu, Fe, Мg). Белковые фракции сыворотки крови определяли нефелометрическим методом.

Иммунологические исследования. Исследования иммунного статуса включали в себя морфологические исследования крови (определение общего количества лейкоцитов в счетной камере с сеткой Горяева, лейкоформулу – дифференциальным подсчетом форменных элементов белой крови на мазках)

77

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

и иммунологические (уровень фагоцитоза – постановкой опсонофагоцитар-

ной реакции; фагоцитарную активность – по проценту фагоцитирующих нейтрофилов к общему числу подсчитанных; фагоцитарный индекс – по чис-

лу микробных клеток в пересчете на один нейтрофил от общего количества подсчитанных нейтрофилов; фагоцитарное число – по числу микробных кле-

ток в пересчете на один активный фагоцитирующий нейтрофил; фагоцитар-

ную емкость – по числу фагоцитирующих нейтрофилов в 1 мкл крови; сти-

мулированный НБТ-тест – в реакции восстановления нитросинего тетразо-

лия; популяции Т- и В-лимфоцитов – методом розеткообразования; количе-

ственное определение IgA, IgM, IgG – путем простой радиальной иммуно-

диффузии; бактерицидную активность – фотонефелометрическим методом при учете изменения оптической плотности питательной среды при добавле-

нии в нее сыворотки крови, лизоцимную активность – нефелометрически по изменению оптической плотности суспензии Microcos Lyzodeiticus после добавления в нее сыворотки крови).

Для оценки эндогенной интоксикации определялся уровень среднемо-

лекулярных пептидов – молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови животных. Для диагностики использовали метод, предложенный Н.И. Габри-

элян и др. (1985). Принцип метода заключается в осаждении белков раство-

ром трихлоруксусной кислоты, с последующим определением МСМ путем прямой спектрофотометрии при длине волны 254 и 280 нм в единицах опти-

ческой плотности. Оценку показателей системы ПОЛ-АОЗ проводили в соот-

ветствии с методическим пособием ВНИВИПФиТ (1997) по изучению про-

цессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма животных.

Статистическая обработка результатов. Полученные в опытах циф-

ровые данные обрабатывались методами математической статистики, приня-

той в биологии и медицине (Лакин Г.Ф., 1990), с помощью программного

78

обеспечения фирмы Mikrosoft ®, фирмы Carl Zeiss ®. Критерий достоверно-

сти определяли по таблице Стьюдента.

С целью получения среднего показателя (М) для обработки данных ис-

следования использовались методы описательной статистики c последую-

щим проведением множественного парного сравнения с помощью критерия Ньюмена-Кейлса при 5% уровне значимости различий (р≤0,05).

Кроме того, проведен расчет экономической эффективности примене-

ния изучаемых препаратов по «Методике определения экономической эф-

фективности ветеринарных мероприятий» (1982).

79

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

3.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1Изучение химического состава природных алюмосиликатов Краснодарского края и Воронежской области, и препаратов на их основе

На территории Краснодарского края имеются следующие месторожде-

ния природных алюмосиликатов (бентонитовых глин): Горячеключевское,

Черноморское (Абинский район), Варениковское (Крымский район), Госта-

гаевское (Анапский район), Бесленевское (Мостовский район), Зассовское

(Лабинский район).

Методом РФА, электронно-микроскопического и электронно-

графического изучения установлено, что образцы природных глин данных месторождений представляют собой полиминеральную систему, основным минералом которой является монтмориллонит (60-70%) – сорбционно-

активный глинистый минерал группы смектитов с идеализированной форму-

лой Al2[Si4O10] (OH)2·nH2O (Рекшинская Л.Г., 1966), с примесью каолинита,

цеолита, вермикулита, иллита и др.

Согласно энергодисперсионному спектру в монтмориллонитах отмеча-

ется наличие в составе следующих элементов: кремния, алюминия, железа,

кальция, калия, магния и др., удельная поверхность составляет 53 м²/г, объем пор – 0,065 см³/г, средний размер мезопор – 4,8 нм, микропор – 1,23 нм; вы-

явлено подавление роста Escherichia coli в 10 раз, подавление роста

Staphylococcus aures – в 10 раз (Бондарев А. В., 2015).

Для изучения физико-химических, а в дальнейшем и фармакологиче-

ских свойств, были отобраны пробы глин голубовато-зеленого и зеленовато-

желтого оттенка Горячеключевского, Черноморского, Гостагаевского и Ва-

рениковского месторождений.

После проведенного мониторинга химического состава этих глин (таб-

лица 2) было обнаружено, что данные пробы глин отличаются повышенным содержанием железа, т.е. по сути, являются монтмориллонитами железистого профиля – нонтронитами (ферримонтмориллонитами).

80