3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

Механизм А

Действие на клетки при синтезе белка и РНК Парадоксальный эффект in vitro

БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТ Ингибирование ДНК-гиразы и синтеза ДНК

Рис. 8. Различные механизмы действия хинолонов и фторхинолонов на клетки микроорганизмов

Причиной развития устойчивости может быть и снижение проницаемости наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Эти мутации затрагивают Omp-белки или липополисахариды. У белков изменяются некоторые свойства (молекулярная масса) либо некоторые типы отсутствуют вовсе. В липополисахаридах отмечают укорочение длинноцепочечного компонента – О-полисахарида. Третьей причиной возникновения резистентных форм следует считать активный выброс (efflux) антибиотика из клетки, обнаруженный у P. aeruginosa. Данный процесс обеспечивается белками оперона mex – opr, что и приводит к резкому снижению внутриклеточного содержания антибиотика.

Следует также отметить, что существуют ингибиторы функционирования и субъединицы В ДНК-гиразы. Это антибиотики новобиоцин

(S. niveus) и коумермицин (S. sphaeroides).

Среди положительных моментов использования данных синтетических препаратов отмечают низкую частоту формирования резистентных форм; незначительные побочные реакции: препараты снимают в 2 % случаев. Ограничено использование препарата в педиатрии, так как может нарушаться рост ювенильных хрящей и развитие скелета.

80

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

На базе фторхинолонов и цефалоспоринов создаются новые лекарственные формы – пролекарства (prodrugs). Между двумя молекулами формируется ковалентная связь. Попадая в клетки совместно, каждый компонент реагирует со своей мишенью. Накапливаются в клетке в больших концентрациях, чем каждая составляющая по отдельности.

Антибиотики-анзамицины с химической точки зрения напоминают макролиды, однако образование цикла происходит через амидную группу. Ароматическая часть молекулы представляет собой либо бензольное, либо нафталиновое ядро. В зависимости от того, какой связью соединяются ароматическая и лактамная часть молекулы (через углерод или кислород), выделяют стрептоварицины и рифамицины. Полусинтетические рифамицины получили название рифампицинов.

Рифампицин связывается с РНК-полимеразой в соотношении 1:1, при этом значение имеет наличие макроциклического кольца. При известной структуре РНК-полимеразы (2α субъединицы, β, β' и σ-фактор) участок связывания рифампицина находится у β-субъединицы. Существует несколько групп доказательств данного факта. Например, фермент, выделенный из устойчивых клеток, не связывает антибиотик, что коррелирует с изменением β-субъединицы. Показано также, что поздняя РНКполимераза фага Т7, утратившая типичную структуру, нечувствительна к рифампицину.

Рифампицин специфически подавляет инициацию синтеза РНК, вероятно, за счет инактивации РНК-полимеразы и индукции в ней конформационных изменений. На первой стадии взаимодействия происходит быстрое связывание фермента и антибиотика, далее следует медленное мономолекулярное изменение конформации фермента, приводящее к проявлению ингибирующего действия антибиотика. Возможно взаимодействие между ароматическими кольцами в молекуле антибиотика и ароматическими аминокислотами в активном центре фермента. Рифампицин мало влияет на образование первой фосфодиэфирной связи, но практически полностью подавляет образование следующей. Однако если образование второй и третьей связи все же произошло, то дальнейший процесс к антибиотику не чувствителен. Устойчивость к рифампицину может быть только хромосомальной и связана с изменением β-субъ- единицы РНК-полимеразы.

Рифамицины были открыты в 1958 году, продуцентом является Nocardia mediterranei. Антибиотик активен в отношении грамположительных бактерий и микобактерий, через наружную мембрану грамотрицательных проникает плохо.

Побочные эффекты от использования антибиотиков незначительны: аллергия, окрашивание тканевых жидкостей в красный цвет, плохое всасывание через желудочно-кишечный тракт.

81

Несколько другим механизмом действия на РНК-полимеразу обладает стрептолидигин: антибиотик подавляет не только инициацию, но и элонгацию синтеза цепи РНК. В присутствии стрептолидигина образуется стабильный комплекс ДНК – РНК-полимераза – антибиотик, что приводит к замедлению продвижения фермента вдоль матрицы.

10. ПРОМЫШЛЕННОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ

После установления лечебных свойств первого антибиотика – пенициллина – сразу же возникла задача организации его массового производства. В настоящее время можно говорить о том, что производство антибиотиков – хорошо развитая отрасль, которая занимает одно из центральных мест в производстве лекарственных препаратов. Огромный спрос на антибиотические препараты со стороны медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности способствовал усиленному поиску новых антибиотиков и получению их в промышленных масштабах. Современное промышленное получение антибиотиков – это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.

1. Стадия биосинтеза (образования) антибиотика, основной за-

дачей которой является создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Высокая результативность этой стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма.

Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающий подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Все это входит в понятие управляемый синтез. На стадии подготовки инокулята следует обратить внимание на состав среды, в которой выращивается организм, на возраст клеток или мицелия. На стадии биосинтеза, кроме состава среды, большую роль играет скорость потребления тех или иных ее компонентов, регуляция процесса аэрации, поддержание соответствующих рН и температуры и других показателей культивирования.

Для максимального снижения себестоимости препарата необходимо:

•внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов – продуцентов антибиотиков;

•создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах;

82

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

•широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с целью оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика;

•применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с контролем основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика.

Всовременных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов – продуцентов антибиотиков является метод глубинного культивирования, суть которого заключается в том, что микроорганизмы развиваются в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается. Наибольшее распространение получила модификация глубинного культивирования, названная непрерывным культивированием, при использовании которого возможно поддержание развития микроорганизмов на определенной стадии роста.

Для изучения условий образования антибиотиков и их производства

впромышленных условиях используются ферментеры, снабженные приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры и контрольно-измерительными приборами. В зависимости от характера работ используют разные типы ферментеров: лабораторные, полупромышленные, промышленные.

Для каждого продуцента разрабатывается оптимальная среда, которая должна соответствовать определенным требованиям:

а) обеспечивать максимальный выход антибиотика; б) состоять из относительно дешевых компонентов; в) иметь хорошую фильтрующую способность;

г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов для выделения и очистки антибиотиков.

Стерилизация питательных сред в промышленных условиях достигается в результате:

•периодического метода для небольших объемов среды, при котором среда нагревается до 120–130 оС непосредственно в ферментере и выдерживается в течение определенного времени;

•непрерывного метода для значительных объемов, при котором приготовленная среда подается в стерилизационную колонку, через которую пропускают острый пар. Нагретая до необходимой температуры среда поступает в специальный аппарат, где выдерживается определенное время.

При подготовке посевного материала микроорганизмы предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирках, затем делают высевы в колбы с жидкой питательной средой. На следующем этапе

83

делают высев в специальный инокулятор небольшого объема (10 л), из которого хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный (100–500 л) ферментер, откуда и делают высев в основной ферментер. Для засева используется объемная доля инокулята 5–10 %.

2. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы продуцента), эффективность которой определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, накоплением антибиотика в культуральной жидкости или внеклеточно.

3. Стадия выделения и очистки антибиотика, особенностью ко-

торой является достигаемое увеличение концентрации антибиотика (примерно от 1 до 20–30 %). В качестве основных методов используются экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, выпаривание, сушка. Если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то вначале его переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно изолировать. Цель химической очистки – извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение от сопутствующих примесей.

4. Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарст-

венных форм, расфасовка, основное требование к которой – высокое качество конечного продукта. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. В первом случае ставится задача выяснения стерильности готового препарата, которая обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата. При фармакологическом контроле предполагается исследование токсичности, пирогенности, аллергенности и других свойств препарата, определенных Государственной фармакопеей. Расфасованный и упакованный препарат с указанием биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.

Выход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л.

Можно отметить, что помимо прямой ферментации, которая описана выше, существует также способ получения полусинтетических производных антибиотиков. Такое производство было разработано с 1960 года, а первым полусинтетическим антибиотиком явился метициллин. Во-

84

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

обще говоря, на основе ферментативного гидролиза 6-аминопени- циллановой (6-АПК) кислоты с помощью фермента пенициллинацилазы, который образуется многими видами микроорганизмов, получено около 40 тыс. полусинтетических производных. 6-АПК оказалась исключительно удобным объектом для введения радикалов вместо атома водорода в аминной группе. В настоящее время в разных странах созданы биотехнологические производства с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы для выделения 6-АПК из бензилпенициллина.

Полученная 6-АПК затем используется для химического синтеза других пенициллинов. Например, при синтезе ампициллина гидролиз бензилпенициллина осуществляют при участии мутанта Kluivera citrophyla, после чего вносят клетки Pseudomonas melanogenium и эфир D, L-фенилглицина, условия процесса подобраны таким образом, что происходит образование ампициллина (D-аминобензилпенициллин).

Некоторые примеры полусинтетических препаратов приведены в табл. 12.

Таблица 12

Общее количество полусинтетических антибиотиков

В условиях мутасинтеза (рис. 9) сочетаются генетический и химический подход к образованию антибиотиков. В этом случае используются мутанты, у которых блокировано определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, последние переводят в аналоги самого антибиотика. Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена способность к ацилированию, образуют аналоги предшественника рифамицина – рифамицин SV, который служит исходным веществом для получения многих рифампицинов.

85

Для продуцентов аминогликозидных антибиотиков также имеются убедительные примеры получения мутасинтетических антибиотиков.

Для представителей родов Streptomyces, Micromonospora, Bacillus полу-

чены мутанты, не образующие дезоксистрептамина, но способные включать его или его аналоги в молекулу антибиотиков. С использованием серии полученных аналогов выделено более 10 производных неомицина, гентамицина, бутирозина, а также 5-эписизомицин, который является наиболее защищенным от действия инактивирующих ферментов.

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны, однако в некоторых случаях пользуются и таким способом. Например, после установления структуры молекулы хлорамфеникола и выяснения, что она не является сложной, был осуществлен химический синтез, и сейчас антибиотик получают только таким путем. В настоящее время используется один из изомеров хлорамфеникола, который получил название левомицетин.

Мутаген

Аналоги

фрагментов

молекулы

антибиотиков

Н О В Ы Е М У Т А С И Н Т Е Т И Ч Е С К И Е А Н Т И Б И О Т И К И

Рис. 9. Создание мутасинтетических антибиотиков

86

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

11. ЗНАЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ ШТАММОВ–ПРОДУЦЕНТОВ.

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА МИКРООРГАНИЗМОВ И СИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ

Необходимость биосинтеза антибиотиков как продуктов вторичного метаболизма для штаммов-продуцентов может быть объяснена исходя из нескольких предположений:

1)антибиотики – остаточные токсичные продукты метаболизма, которые именно в таком виде должны быть удалены из клетки. Подобная точка зрения вряд ли может быть справедливой по нескольким причинам: слишком многие вторичные метаболиты обладают биологической активностью, а предшественниками их образования являются весьма важные первичные метаболиты, на синтез которых затрачивается много энергии и которые могли бы быть использованы клеткой;

2)несомненным является значение продукции антибиотиков как фактора, способствующего выживанию продуцентов. Особенно справедливо это предположение для медленно растущих видов, например актиномицетов;

3)наиболее распространенной в настоящее время является точка зрения, в соответствии с которой считается, что антибиотики синтезируются не только и не столько для конкуренции, а для изменения метаболизма собственного продуцента. Их образование в определенной стадии роста может приводить к блокированию специфических функций обмена

ик индукции клеточной дифференцировки. Весьма подходящей кажется такая гипотеза для антибиотиков с пептидной структурой или ионофорных антибиотиков.

Процесс дифференцировки клеток микроорганизмов затрагивает разные уровни организации: клеточный и субклеточный, колониальный

ипопуляционный – и осуществляется во временном и пространственном отношениях.

Изменения, происходящие при продукции антибиотиков на клеточном и субклеточном уровнях, лучше описаны и охарактеризованы для грибов и актиномицетов.

Для штаммов Actinomyces spp. по мере перехода к образованию антибиотиков наблюдается утолщение клеточной стенки, в цитоплазме образуются полисомы, развиваются внутрицитоплазматические мембранные структуры. Такие мембранные структуры ограничивают продуцируемый антибиотик (тетрациклин) от внутриклеточного содержимого, защищая тем самым клетки, и способствуют выделению антибиотика.

87

Изменения такого же рода наблюдаются и у продуцента хлорамфеникола: наличие электронно-прозрачных мембранных образований связывают с выделением антибиотика в среду. Для продуцента линкомицина (S. roseolus) в период наибольшей продуктивности мицелия характерно утолщение клеточной стенки, образование молодых гиф внутри материнской.

Для B. polymyxa, образующего полимиксин В, показано, что в продуцирующих клетках изменяется структура клеточной стенки, усложняется мезосомальный аппарат. Начало процесса дифференцировки в эндоспоры коррелирует с высоким содержанием антибиотика.

На колониальном уровне зависимость между продукцией антибиотиков и дифференцировкой также более четко прослеживается для грибов и актиномицетов. Колонии продуцентов обычно более компактные, складчатые, нередко имеют различия в окраске воздушного и субстратного мицелия, а также способности продуцировать растворимый пигмент. У большинства штаммов-продуцентов потеря способности образовывать воздушный мицелий соответствует потере способности продуцировать антибиотик. Варианты с нарушенной дифференциацией (олигоспоровые, аспорогенные) характеризуются пониженной антибиотической активностью или лишены ее. У ряда грибов суперпродуцентов отмечается снижение темпов роста колоний и споруляции.

Для мицелийобразующих продуцентов отмечают разный характер роста мицелия в различных частях колонии. По профилю колонии отмечают изменение дегидрогеназной, фосфатазной активности, распределения белка и РНК. Для продуцентов, обладающих флуоресценцией, с помощью методов локализационно-топографической люминесценции выявлено, что основная масса антибиотика в колонии локализуется в субстратном мицелии (тетрациклин, D-актиномицин).

На популяционном уровне связь между дифференцировкой и образованием антибиотика заключается в том, что до начала образования антибиотика культура проходит ряд ростовых фаз, антибиотик синтезируется только после наступления соответствующей, когда завершается синтез необходимых ферментов и предшественников. Как правило, образование антибиотиков происходит в условиях, не благоприятных для роста продуцента. Следует учитывать, что образование антибиотика зависит и от условий культивирования, и от внешних факторов.

Для актиномицетов и грибов, продуцирующих антибиотики, характерна полицикличность развития, когда организм в процессе ферментации проходит 2–3 генерации с частичным автолизом мицелия в каждой из них. У грибов это обусловлено образованием фрагментов гиф, кони-

88

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

дий, артроспор, гемм, способных к прорастанию и последующему развитию новых поколений глубинного мицелия, что коррелирует с наибольшей продуктивностью. Для продуцентов цефалоспорина показано, что максимальная способность к синтезу антибиотиков наблюдается на стадии артроспор.

Несомненный практический интерес представляют вопросы изучения защитных механизмов продуцентов от образуемых антибиотиков. Во-первых, гены резистентности продуцентов могут передаваться другим природным бактериям и в последующем распространяться среди клинических изолятов. Во-вторых, наличие и изучение этого процесса у продуцентов имеет практическое значение при создании штаммовсуперпродуцентов. В-третьих, интересным является исследование вопросов о возможности использования полученных сведений при отборе продуцентов. Тем не менее следует отметить, что существуют различия в механизмах защиты у промышленных штаммов суперпродуцентов и их природных аналогов.

По отношению к продуцирующему штамму с 1979 года все извест-

ные в настоящее время антибиотики принято делить на две группы:

1)ксенотоксические, или действующие только на метаболизм других штаммов и не имеющие мишени в клетках собственного продуцента;

2)аутотоксические, или имеющие мишени для действия в клетках собственного продуцента и, следовательно, проявляющие определенные защитные механизмы.

Очевидно, что такое деление является условным. Например, для

β-лактамных антибиотиков, продуцентами которых являются штаммы Penicillum, образуемые антибиотики являются ксенотоксичными, но по отношению к продуцентам-бактериям – аутотоксичными.

К чисто ксенотоксическим антибиотикам относятся антимицины – ингибиторы функционирования дыхательной электронтранспортной цепи митохондрий за счет взаимодействия с убихинон-цитохромными ферментами. Продуцентом данной группы антибиотиков являются бактерии S. antibioticus. Анизомицины – ингибиторы биосинтеза белка на

80S рибосомах, а продуцируются они S. griseolus и S. roseochromogenes.

Актиномицеты S. cacaoi продуцируют полиоксины – антибиотики, ингибирующие биосинтез клеточной стенки грибов. Такие антибиотики, как бицикломицин и глобомицин, ингибируют функционирование наружной мембраны грамотрицательных бактерий, однако продуцируются стрептомицетами, т. е. бактериями грамположительными.

Очевидно, что для аутотоксических антибиотиков должны существовать защитные механизмы. Это значит, что весь метаболизм продуцен-

89