3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

8.Антибиотики-гликопептиды (ванкомицин, ристомицин), имеющие несколько остатков углеводов, соединенных с циклопептидным агликоном.

9.Металлосодержащие антибиотики, среди которых имеются железо- (сидеромицины, альбомицин, гризеин) и медьсодержащие (флеомицин) соединения.

10.Соединения с другой структурой, среди которых можно выделить ароматические соединения (хлорамфеникол); антибиотики, сходные

снуклеозидами (линкомицин), и др.

4. ОБРАЗОВАНИЕ АНТИБИОТИКОВ В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Считается, что лучшими продуцентами антибиотиков являются почвенные организмы, причем около 3000 всех известных соединений с антибиотической активностью образуют представители актиномицетов. На проявление способности продуцировать антибиотики оказывает воздействие весь сложный комплекс условий культивирования или существования продуцента.

Влабораторных условиях биосинтез многих антибиотиков (как и других вторичных метаболитов) происходит во время определенной стадии роста культуры. С этой точки зрения, по предложению Б. Локка, рост популяции продуцентов можно разделить на две стадии: трофофазу (или фазу сбалансированного роста) и идиофазу (или фазу несбалансированного роста). В первой происходит интенсивный синтез таких соединений, как белки, нуклеиновые кислоты, ферменты, некоторые органические кислоты; во второй – относительно окисленные продукты синтеза первой фазы потребляются, и происходит образование большинства вторичных метаболитов (антибиотиков, пигментов и др.), т. е. относительно восстановленных соединений.

Взависимости от участвующих в процессе биосинтеза веществ антибиотики могут быть образованы следующим образом:

1)из единственного предшественника – первичного метаболита. Их синтез – цепь реакций, модифицирующих исходный продукт таким же образом, как при синтезе аминокислот или нуклеотидов. Примером такого рода синтеза является образование хлорамфеникола через типичный для ароматических соединений путь шикимовой кислоты;

2)из двух-трех различных предшественников, которые модифицируются и конденсируются с образованием сложных молекул. За счет конденсации двух аминокислот происходит биосинтез линкомицина. Антибиотик новобиоцин образуется из замещенной бензойной кислоты, аминогидрооксикумарина (оба – производные тирозина) и сахара новиозы;

20

3) путем олигомеризации или полимеризации близких по структуре мономеров через образование основной структуры, которая впоследствии может модифицироваться. По такому механизму происходит биосинтез четырех основных групп антибиотиков:

а) из аминокислот образуются полипептидные и депсипептидные; б) из ацетат-пропионатных единиц (по типу синтеза жирных кис-

лот) – тетрациклины, рифамицины, макролиды; в) из ацетатных единиц при конденсации до изопреновых структур –

фузидиевая кислота; г) из сахаров (по типу синтеза полисахаридов) – аминогликозиды.

Известно не менее 300 соединений, которые относятся к антибиотикам с полипептидной структурой и образование которых можно рассматривать как результат конденсации аминокислот с образованием пептидных связей. Они отличаются от обычных белков тем, что их молекулярная масса не превышает 3000, а в их составе обнаруживаются необычные аминокислоты, например в D-форме, метилированные или оксиаминокислоты. Такие структуры склонны к циклизации или гиперциклизации.

Считается, что в биосинтезе полипептидных антибиотиков не участвует рибосомная система, и, соответственно, процесс носит название нерибосомного синтеза. В подтверждение рассматриваются факты, свидетельствующие о том, что процесс не чувствителен к ингибиторам биосинтеза белка и что в составе пептидных антибиотиков обнаруживаются необычные аминокислоты.

В качестве примера синтеза полипептидных антибиотиков можно рассмотреть биосинтез грамицидина С – декапептидного циклического соединения, состоящего из двух идентичных пентапептидных цепей. Биосинтез катализируется двумя растворимыми ферментными белками – Н (280 тыс.) и L (100 тыс.). В присутствии этих ферментов экстракты клеток B. brevis при наличии АТФ, катионов Mg2+, соответствующих аминокислот могут синтезировать антибиотик. Фермент с большей молекулярной массой связывает четыре молекулы АТФ и четыре аминокислоты, в результате этого образуются тиоэфиры активированных аминокислот. Далее остатки аминокислот, активированные за счет АТФ, связываются с –SH группами этого фермента, возможно, через остатки цистеина. На молекуле фермента имеется четыре независимых сайта связывания для каждой аминокислоты.

Для инициации синтеза полипептида необходимо также и участие L-фермента. Его роль сводится к связыванию и активации с участием АТФ молекулы L-фенилаланина, в результате такого взаимодействия происходит рацемизация, и в молекулу антибиотика аминокислота включается в D-форме.

21

Собственно образование пептидных связей начинается с переноса активированного D-фенилаланина, связанного с L-ферментом, на фермент Н и связывания этой аминокислоты с молекулой L-пролина. В дальнейшем происходит образование связи между аминогруппой очередной аминокислоты и карбоксильной группой строящегося пептида, и в реакции участвует только фермент H. Полимеризация двух активированных пентапептидов осуществляется в случае, если два ферментных комплекса, несущих активированные аминокислоты, соединенные пептидными связями, объединяются (рис. 2).

Пептидные антибиотики не содержат более 15–20 аминокислот, так как маловероятно, что ферментный комплекс удерживал бы большее их количество. Синтез полипептидных антибиотиков осуществляется семействами, отдельные представители которых различаются заменой одной или нескольких аминокислот. Это, возможно, объясняется тем, что происходит ошибочное связывание аминокислот с ферментными комплексами либо аминокислоты конкурируют друг с другом за возможность включения в молекулу антибиотика.

По такому же механизму происходит и образование таких широко известных антибиотиков, как пенициллины и цефалоспорины. Основу молекулы составляют L-цистеин, D-валин и L-α-аминоадипиновая кислота.

Рис. 2. Синтез полипептидных антибиотиков

22

Первым этапом биосинтеза считается образование трипептида, который последовательно превращается в моноциклический β-лактам, затем в изопенициллин N и 6-аминипенициллановую кислоту (6-АПК). Последняя является исходной при получении полусинтетических пенициллинов. При биосинтезе цефалоспоринов процесс происходит сходным образом до образования изопенициллина N, после появления этого соединения пути биосинтеза молекул расходятся. Дополнительными этапами являются гидроксилирование и ацетилирование молекул.

В группе антибиотиков, образующихся путем конденсации ацетатных и пропионатных единиц, обнаруживаются разные по структуре молекулы: изолированные или конденсированные ароматические, хиноны, макролиды, анзамицины. Реакции их образования близки к реакциям биосинтеза жирных кислот. Такие антибиотики образуются микроорганизмами под действием мультиферментного комплекса с участием моле- кулы-затравки, которая связывается с ним.

Принципиальные отличия синтеза жирных кислот от синтеза вторичных метаболитов-антибиотиков заключаются в следующем:

1)восстановление карбонильных групп может не происходить, и образуются ароматические структуры; если оно все же осуществляется частично до стадии гидроксильной группы или двойной связи, то образуется макротетралид;

2)при синтезе антибиотиков может использоваться метилмалонат и образуются метилированные цепи;

3)активатором – инициатором процесса может быть не только уксусная кислота, но и пропионат, изовалериановая кислота, малониламид

идругие соединения.

Структура антибиотика определяется главным образом длиной цепи и степенью ее восстановленности. Если цепь образована исключительно из ацетатных единиц и группы С=О не восстановлены, образуются поликетидные структуры. Согласно стерическим представлениям образуются шестичленные кольца ароматической природы. Если карбонильная группа восстанавливается частично и циклизация затруднена, то получаются линейные структуры или макроциклы.

Один из примеров – образование тетрациклинов. Исходными структурными единицами являются восемь молекул малонил-КоА и одна молекула малониламин-КоА. Первым общим предшественником для всех тетрациклинов является метилпрететрамид, для его образования используется примерно 50 ферментных систем, а последующие 11 реакций приводят к образованию молекулы антибиотика. Исключительно важное значение имеет наличие НАДФН+, необходимыми являются три молеку-

23

лы – продукт пентозофосфатного пути утилизации глюкозы. Следовательно, они образуются раньше, чем используются для биосинтеза антибиотика. Был постулирован тот факт, что чем ниже уровень реакций в ЦТК, тем более высоким является выход тетрациклина. Считают, что продуктивный штамм имеет дефект в энергетическом обмене, в результате чего усиливается утилизация уксусной кислоты для синтеза тетрациклина.

Биосинтез эритромицина является еще более сложным, так как в структуру молекулы входят макроцикл, сахара и необходима конденсация этих соединений. Структурной основой является одна молекула про- пионил-КоА и шесть молекул метилмалонил-КоА. Первоначально синтезируется эритронолид В, который далее циклизуется и превращается в различные формы эритромицина (А, В и С) после присоединения сахаров – производных глюкозы. Все реакции происходят в мультиферментном комплексе, от которого молекулы отщепляются после полного синтеза. Способность производных пропионовой кислоты и пропилового спирта участвовать в биосинтезе в качестве предшественника молекулы используется на практике: при ферментации их вводят в ферментационную среду, что значительно повышает выход антибиотика.

Молекула стрептомицина представлена двумя функциональными частями: стрептидином, не обладающим антибиотической активностью, и стрептобиозамином – дисахаридом, в составе которого имеется метилированный глюкозамин и не содержащая азота стрептоза. Обобщая данные по биосинтезу стрептомицина культурой S. griseus, можно предложить следующую схему:

S. griseus

Глюкоза – 3 молекулы Метионин – 1 молекула стрептомицин

Аргинин – 2 молекулы

Витамин В12

Вопрос о регуляции синтеза того или иного продукта сводится практически к вопросу о регуляции синтеза или изменению активности ферментов, участвующих в процессе. Ферменты, участвующие в синтезе вторичных метаболитов, обладают меньшей субстратной специфичностью, чем ферменты первичного метаболизма. Это связано с тем, что ошибки в специфичности работы последних скорее всего летальны для клетки, в то время как при биосинтезе вторичных метаболитов они могут быть даже полезны, если синтезируемое с их помощью соединение сохраняет биологическую активность.

24

Ферменты, участвующие в биосинтезе антибиотиков, могут быть разделены на три группы:

1)образующие и модифицирующие промежуточные продукты метаболизма, которые являются исходными для синтеза данного антибиотика. Такие продукты образуются путем конденсации первичных предшественников, например АсКоА, который может быть превращен в мевалоновую кислоту, поликетидные структуры;

2)катализирующие образование первичных предшественников, например малоната, метилмалоната, их ацилированных производных;

3)образующие первичные метаболиты, которые затем включаются в синтез вторичных, например ферменты биосинтеза валина и цистеина, аминокислот, составляющих молекулу антибиотика.

Относительно механизма, который обусловливает образование антибиотика именно в идиофазе, можно сказать, что синтез ферментов, ответственных за это в период трофофазы, подавлен, после ее окончания должна наступить дерепрессия их синтеза. Возможны несколько механизмов обеспечения данного процесса.

1. Индуктор, дерепрессирующий гены биосинтеза, должен накапливаться после окончания роста культуры или добавляться извне. В настоящее время описаны несколько химических веществ, которые рассматриваются как регуляторы внутриклеточных процессов, в том числе и антибиотикообразования. Они способны действовать одновременно на несколько процессов. Например, косинтетический фактор I (Streptomyces aureofaciens) способен индуцировать образование хлортетрациклина у малоактивного штамма, 1 мкг его индуцирует образование 50 000 мкг/мл антибиотика. Фактор IM (Streptomyces virginiae) индуцирует образование стафиломицина.

Наиболее хорошо изученным является фактор А и его продукция и участие в процессах биосинтеза стрептомицина. Продукция данного вещества была обнаружена А. Хохловым в 1970-х годах. Изучение различных по активности мутантов показало, что при совместном выращивании ряда из них можно получить такой же выход антибиотика, как и при выращивании высокоактивного продуцента. В дальнейшем было обнаружено, что один из неактивных в отношении синтеза антибиотика мутантов нуждается в крайне небольшом количестве вещества, которое образуется малоактивным штаммом, причем это количество настолько мало, что оно не может рассматриваться как продукт промежуточного метаболизма:

0,001 мкг вещества А, прибавленного к нулевому мутанту, вызывает образование 1000 мкг стрептомицина, т. е. коэффициент индукции равен 106.

Впоследствии было показано, что фактор А относится к неспецифическим регуляторам биосинтеза антибиотиков и других процессов. Моле-

25

кулярная масса А-фактора – 342, представляет он собой 2S-изокапроноил- 3S-оксиметил-γ-бутирлактон. Для фактора А в клетках существует специфический рецепторный белок, обозначенный как Arp A, который действует как репрессор во время ранних стадий роста. После внутриклеточного накопления фактора А и связывания его с Arp A белком последний высвобождается от ДНК, где он связан с гипотетическим геном Х, который регулирует экспрессию так называемых генов adp (А-фактор зависимые белки). Морфологические особенности определяет аdp В ген, в то время как другие гипотетически влияют на синтез стрептомицина.

Размер белка Arp A – 24–29 кДа, также как и других белков такого типа (Bar A и IM-2; гены barA и farA). Данные белки имеют примерно на 40 % сходный состав. На N-концевом участке имеется последовательность спираль – клубок – спираль, которая связывается с ДНК; на С-концевом участке – фрагмент с высокой специфичностью связывания с бутиролактонами. Arp A, Bar A и IM-2 являются транскрипционными регуляторами, которые предотвращают экспрессию определенных генов. После достижения (по мере роста культуры) критических концентраций факторов-лактонов они связываются с белками. Как неспецифический регулятор, фактор А принимает участие в образовании мицелия у Streptomyces griseus.

Помимо неспецифических, известны и специфические регуляторы процесса образования антибиотиков. Это гены – регуляторы соответствующих оперонов, например биосинтеза стрептомицина (strR) и спектиномицина (srmR). Их белковые продукты связываются с ДНК в области промоторов и активируют структурные гены.

2. В трофофазе конечный продукт первичного метаболизма по типу обратной связи вызывает подавление одной или нескольких реакций на пути синтеза антибиотика. Истощение этого продукта приводит к дерепрессии генов, ответственных за синтез антибиотиков – продуктов идиофазы. Репрессия синтеза антибиотика конечным продуктом возможна в двух вариантах: сам антибиотик является тем метаболитом, который угнетает активность определенного фермента. Например, при биосинтезе хлорамфеникола, на этапе присоединения азотсодержащего радикала, образующийся продукт может подавлять активность ферментов начальных этапов.

Иная ситуация наблюдается при биосинтезе пенициллина. В этом случае ингибитором является лизин, т. е. один из продуктов первичного метаболизма, который ингибирует активность гомоцитратсинтазы – первого фермента, который участвует в образовании аминоадипиновой кислоты, включающейся в молекулу антибиотика.

26

3.Рост на легкоутилизируемом источнике углерода ведет к подавлению активности генов в идиофазе вследствие катаболитной репрессии. Истощение источника углерода приводит к дерепресии генов. Было отмечено влияние явления катаболитной репрессии на биосинтез пенициллина: добавление глюкозы к культуре Penicillum в высоких концентрациях приводит к снижению уровня синтеза антибиотика. На практике для устранения подобного явления глюкозу вводят в среду дробно. Катаболитной репрессии подвержен и синтез многих пептидных антибиотиков.

4.Синтез вторичных метаболитов (антибиотиков) подавляется высоким энергетическим зарядом в клетке. Истощение АТФ приводит к дерепрессии генов их биосинтеза.

5.РНК-пролимераза во время трофофазы может осуществлять транскрипцию только генов, ответственных за синтез продуктов трофофазы, и не может присоединяться к промоторам генов, активных во время идиофазы. После завершения трофофазы происходят конформационные изменения РНК-полимеразы, и она способна присоединяться к промоторным участкам соответствующих генов и инициировать синтез ферментов биосинтеза вторичных метаболитов.

5. КЛЕТОЧНАЯ МЕМБРАНА И ВЕЩЕСТВА, НАРУШАЮЩИЕ ЕЕ ЦЕЛОСТНОСТЬ

Помимо антибиотиков, которые используются при приеме внутрь, всасывании и циркулировании в крови, часто возникает необходимость в использовании веществ, угнетающих рост микроорганимзов в целом, на поверхности тела или каких-либо объектов. Для обозначения таких веществ используют несколько названий: стерилизующие, дезинфицирующие, антисептические, биоцидные. Их использование входит в состав противомикробных мероприятий, под которыми понимают совокупность способов и методов уничтожения, подавления численности популяции и ограничения распространения потенциально патогенных для человека микроорганизмов.

Косвенные противомикробные мероприятия – снижение распространения микроорганизмов, их численности, создание неблагоприятных условий для размножения. Прямые противомикробные мероприятия – полное или селективное освобождение от микробов объектов внешней среды или живых организмов.

В зависимости от области применения выделяют следующие мероприятия:

1) стерилизация – совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и по-

27

коящихся форм микроорганизмов. Стерилизующими агентами являются горячий насыщенный пар под давлением, сухой жар, кипячение и прокаливание, холодная стерилизация (окись этилена, пары формалина и др.); 2) дезинфекция – совокупность способов полного, частичного или селективного удаления (уничтожения) потенциально патогенных для человека микроорганизмов на объектах внешней среды с целью разрыва путей передачи возбудителей. Дезинфицирующий эффект может быть достигнут путем сжигания материала или объекта, обработки УФ светом, ультразвуком. Чаще используют дезинфектанты (хлорамин, фенол, крезол, четвертичные соединения аммония), вещества, к которым предъяв-

ляют особые требования:

•широкий спектр действия;

•наличие бактерицидных свойств;

•хорошая растворимость в воде или образование стойких суспензий, аэрозолей в воздухе;

•низкая токсичность и аллергенность.

Специфика некоторых противомикробных мероприятий показана в табл. 5.

Таблица 5

Сравнительная характеристика некоторых противомикробных мероприятий

28

Антисептики – химические соединения, которые обладают противомикробным действием и используются для нанесения на кожу, слизистые оболочки, полости и раны в целях лечения и предупреждения развития местных инфекционных поражений и сепсиса. Разделить антисептики можно на три группы:

1)неорганической природы (галогены и их производные, перекись водорода, марганцевокислый калий, борная кислота и др.);

2)биоорганической природы (антибиотики – полимиксины и грамицидины, экстракты календулы, чеснока, эвкалипта, лизоцим);

3)органические антисептики абиогенного происхождения (органические производные хлора, иода, брома, молочная, салициловая кислота

идр.).

Рассмотрим механизмы противомикробного действия антисептиков.

1.Деструктивный механизм подразумевает разрушение структур и макромолекул клетки в присутствии антибиотика, что не позволяет им выполнять свои функции.

Деструкцию могут вызывать химические вещества, температура, ультразвук, соли тяжелых металлов, поверхностно-активные вещества. Молекулы, которые имеют в своем составе гидроксильные или карбонильные группы, двойные связи, разрушаются в основном за счет окисления. Биополимеры типа белков, полиэфиров – под действием окислителей, детергентов. Наиболее подвержена деструкции мембрана, у которой изменяется целостность, – таким образом наступает гибель клетки. Применение антисептиков этой группы может иметь отрицательные последствия для макроорганизма (оказывают раздражающее действие, вызывают повреждение кожи, слизистых оболочек и т. д.).

2.В соответствии с окислительным механизмом активности антисептиков (перекись водорода, иод, марганцевокислый калий) на первом этапе взаимодействия с химическими веществами клетки происходит отсоединение от антисептика кислорода, его активация и образование промежуточных перекисных продуктов – гидроксил-иона и др. На втором этапе активированный кислород и промежуточные продукты взаимодействуют с реакционноспособными группами соединений микробной клетки, в результате чего происходит полная деструкция молекул или возникают солеобразующие или несолеобразующие комплексы с молекуламимишенями. Изменения носят необратимый характер, и, следовательно, окислители имеют бактерицидный эффект. Например, в растворе марганцевокислого калия марганец в кислой среде переходит в четырехвалентное, а в щелочной – в двухвалентное состояние с выделением атомарного кислорода, который окисляет соединения, входящие в состав поверхностных структур бактериальной клетки.

29