3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

та, и первичный, и вторичный, должен быть отделен и защищен от молекулы антибиотика. Чаще всего такие механизмы рассматривают на биохимическом уровне, а их классификация выглядит следующим образом:

1)изменение конформации мишени для действия антибиотика (например, участка рибосомы);

2)сверхпродукция молекул-мишеней (например, фермента);

3)наличие в клетке обходного пути метаболизма, который является мишенью для действия антибиотика;

4)сверхпродукция метаболита антагониста (например, цистеина для пенициллина, глиотоксина);

5)некоторые случаи толерантности к антибиотику (например, про-

дукция β-лактамов и снижение продукции аутолитических ферментов);

6)избирательное снижение проницаемости мембраны по отношению к антибиотику;

7)внутриклеточная детоксификация антибиотика (например, фосфорилирование для неомицина).

Для продуцента эритромицина защита проявляется на двух уровнях. На рибосомном, когда биосинтез белка на рибосомах продуцента подавляется значительно более высокими концентрациями антибиотика, нежели у непродуцирующих вариантов, что объясняют практически полным отсутствием связывания его с рибосомами. На мембранном уровне отмечают избирательное поступление антибиотика в мицелий после его секреции, хотя для других антибиотиков избирательности поступления в клетки продуцента не отмечается.

Снижение проницаемости мембраны свойственно и продуцентам линкомицина, хлорамфеникола. Для последнего также существует защита на уровне продукции гидролаз, внеклеточно инактивирующих антибиотик.

Для продуцентов аминогликозидных антибиотиков характерно наличие механизма защиты на рибосомном уровне. Кроме того, для них описаны системы защиты с участием фосфо- и ацетилирующих фермен-

тов. Для антибиотиков – ингибиторов синтеза пептидогликана (β-лак- тамных) основной механизм защиты связан с изменением конформации транспептидазы и набором и составом пенициллинсвязывающих белков.

У продуцентов тетрациклина белоксинтезирующая система оказалась в 20 раз более устойчивой к определенным концентрациям антибиотика (или к концентрациям в 20 раз более высоким). Отмечается также и влияние физиологического состояния клеток на устойчивость. Так, молодые культуры в трофофазе, т. е. не продуцирующие антибиотик, ус-

90

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

тойчивы к 50 мкг/мл, в то время как на завершающих стадиях жизненного цикла – к 2000 мкг/мл. Кроме того, отмечают внутриклеточную компартментализацию, обеспечивающую отделение антибиотика от содержимого цитоплазмы.

Для актиномицина Д, ингибитора транскрипции, обнаружено три механизма защиты:

1)на уровне мишени: как ДНК-, так и РНК-полимеры способны обходить прореагировавший с антибиотиком участок молекулы ДНК;

2)связывание в клетке актиномицина специфическими белками во время идиофазы, что уменьшает количество антибиотика в свободной активной форме;

3)снижение обратного поступления антибиотика в клетку на стадии трофофазы, что, кроме того, снимает ингибирование его синтеза по типу обратной связи.

12.ПРИМЕНЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ

ВСЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ, ПИЩЕВОЙ

ИКОНСЕРВНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

При выборе антибиотика для борьбы с возбудителями заболевания и очагом его распространения, а также способа применения препарата основное внимание обращают не только на биологический эффект, но и на экономический и экологический аспекты. Одно из существенных требований к антибиотикам для сельского хозяйства – они не должны использоваться в медицинской практике. Основные требования, предъявляемые к антибиотикам, используемым в борьбе с фитопатогенными организмами, сводятся к следующему:

1)антибиотик должен быть активным в отношении возбудителя заболевания, т. е. обладать специфичностью биологического действия;

2)должны легко проникать в ткани растения;

3)лечебные дозы должны быть безвредны для растения;

4)антибиотик на поверхности и внутри растения не должен быстро инактивироваться, но, попадая в почву, легко разлагаться там;

5)обладать биологическим действием внутри тканей растения;

6)не наносить ущерба окружающей среде.

Наиболее широко используемым методом является непосредственная обработка почвы, обрызгивание или опыление антибиотиками наземных частей растения, смачивание семян, корней или других органов и

91

т. п. Попав в ткани растения, антибиотики сохраняются там сравнительно долго – от 5 до 20 суток. Из большого числа антибиотиков, испытанных с целью применения для борьбы с различными заболеваниями растений, наибольший эффект наблюдается при использовании стрептомицина, гризеофульфина, циклогексамида и некоторых других.

Стрептомицин используется для борьбы с возбудителями, вызывающими бактериальное увядание фасоли и сои; болезнями косточковых (в США); хлопка, риса (в Индии). В некоторых странах выпускают препараты стрептомицина с окситетрациклином, известные как «агримицин», «фитомицин», «фитостреп».

Биалофос – гербицид, полученный в начале 1980-х годов из культуры S. hydroscopicus. По своей структуре представляет трипептид, состоящий из двух остатков L-аланина и L-глутаминовой кислоты.

Антибиотики широко используются в животноводстве как лечебные средства против заболеваний сельскохозяйственных животных, птиц и пчел. С другой стороны, антибиотики применяются и как стимуляторы роста ряда сельскохозяйственных животных и птиц. Даже их небольшие количества вызывают значительное сокращение отхода молодняка, ускоряют рост и развитие животных и птиц, что в свою очередь связано с сокращением расхода кормов на 5–10 %.

Рассматривая действие антибиотиков на микрофлору кишечника, отмечают следующее:

1)они способствуют увеличению количества микроорганизмов, синтезирующих витамины и преобладающих над патогенной флорой; уменьшают количество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

2)способствуют перемещению микроорганизмов в кишчнике животных;

3)снижают вероятность субклинических инфекций, повышают общий тонус защитных реакций организма;

4)снижают рН кишечного содержимого, уменьшают поверхностное натяжение клеток организма и ускоряют их деление.

Действие антибиотиков на рост животных, прежде всего, связано с изменением кишечной микрофлоры, хотя отмечают и непосредственное влияние этих веществ на организм животного:

1)ткани увеличивают скорость абсорбции и потребление метаболитов, снижая расход кормов;

2)в организме отмечается синергизм гормонов, увеличивается количество ростовых гормонов; усиливается процесс потребления пищи, возрастает приспособляемость организмов к неблагоприятным факторам;

92

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

3) снижается потребность животного в витаминах, увеличивается их синтез, снижается образование метана, возрастает количество летучих кислот, которые потребляются животными.

Среди наиболее распространенных антибиотиков можно отметить авермектины, используемые для подавления развития паразитов, в том числе нематод; монензин для лечения кокцидоза домашней птицы; линкомицин для лечения дизентерии; новобиоцин для лечения холеры индеек.

Первые сведения об использовании антибиотиков в консервной промышленности относятся к 1943 году. К таким антибиотикам относятся субтилин, низин и др.

Применение антибиотиков при консервировании позволяет значительно снизить время термической обработки того или иного продукта. Так, для консервирования овощей предложено использовать субтилин, под действием которого наблюдается гибель клостридиальных и термофильных бактерий.

Низин – антибиотик, образуемый молочнокислыми бактериями, используется при консервировании не только овощей (томаты, зеленый горошек, цветная капуста), но и рыбы, молока, сыров и др. Антибиотик подавляет развитие ряда термофильных спорообразующих бактерий, не оказывая токсического действия на организм человека.

93

и β-лактамаз. β-Лактамазы как ферменты, их особенности. Современные системы классификации. Понятие об ингибиторах β-лактамаз. Роль плазмид и транспозонов в распространении устойчивости к пенициллинам и цефалоспоринам. Поиск ингибиторов β-лактамаз как направление при создании препаратов новых поколений.

Характеристика антибиотиков – ингибиторов процесса биосинтеза белка. Аминогликозидные антибиотики, их химическая структура и разнообразие. По-

ступление аминогликозидов в клетки бактерий, стадии процесса. Механизм биологического действия (на примере стрептомицина). Ферментативный механизм устойчивости и роль плазмид в распространении детерминант резистентности. Действие аминогликозидных антибиотиков на макроорганизм: отрицательные эффекты.

Антибиотики группы тетрациклинов. Их открытие, химическая структура. Поступление тетрациклиновых антибиотиков в клетки микроорганизмов. Механизм антибактериального действия. Особенности развития устойчивости к данным препаратам. Классификация детерминант устойчивости. Использование антибиотиков тетрациклинового ряда в антибиотикотерапии.

Характеристика антибиотиков – ингибиторов функционирования больших субъединиц рибосом. Группа макролидных антибиотиков, особенности их химического строения и действия на бактериальную клетку. Типы устойчивости к антибио- тикам-макролидам. Использование макролидных антибиотиков в сельском хозяйстве.

Характеристика антибиотиков, взаимодействующих с ДНК. Противоопухолевые соединения и механизмы их действия. Влияние данных препаратов на макроорганизм.

Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, их общая характеристика. Рифампицин и ингибирование активности РНК-полимеразы.

Группа синтетических сульфаниламидов и фторхинолонов, ингибирование синтеза пуринов и репликации ДНК. Поступление фторхинолонов в клетку, особенности действия на ДНК-гиразу. Современные представления о механизмах устойчивости к фторхинолонам.

Использование антибиотиков в сельском хозяйстве, пищевой и консервной промышленности. Характеристика препаратов типа пробиотиков и эубиотиков.

ЛИТЕРАТУРА

Основная

1.Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высш. шк., 1994.

2.Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М.: Мир, 1985.

3.Машковский М. Д. Лекарственные средства: В 2 т. Харьков: Торсинг, 1998.

4.Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К Поздеев. М.: Гэотар Медицина, 1999.

5.Молекулярные основы действия антибиотиков / И. Гэйл, Э. Кандлифф, П. Рейнолдс и др. М.: Мир, 1975.

6.Сазыкин Ю. О., Навашин П. С. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. ВИНИТИ. 1991. Т. 31. С. 1–187.

7.Смирнов В В., Василевская А. И., Резник С. Р. Антибиотики. Киев: Вища школа, 1985.

Дополнительная

Научные обзоры в журналах «Биотехнология», «Биохимия», «Прикладная биохимия и микробиология» и «Антибиотики и химиотерапия» за 1995–2003 годы.

95

Состав и приготовление необходимых питательных сред. Солевой концентрат М9 (г/л): Na2HPO4 – 60; KH2PO4 – 30; NaCl – 5; NH4Cl – 10; рН – 7,2.

Для приготовления глюкозо-солевой среды в стерильный флакон добавляли 30 мл солевого концентрата; 6 мл стерильного раствора 20 % глюкозы; 3 мл 0,1 М раствора MgSO4; 3 мл 0,01 М раствора CaCl2.. Полученную смесь доводили до 300 мл 2 % агаром.

Для приготовления 0,7 % агаризованной глюкозо-солевой среды полученную смесь доводили до 300 мл 2 % агаром и глюкозо-солевой средой.

Для приготовления жидкой питательной среды полученную смесь доводили до 300 мл стерильной дистиллированной водой.

Задание 1. Учесть результаты эксперимента по определению антагонистической активности и определить наиболее активные штаммыпродуценты.

Задание 2. Выбрать две индикаторные культуры, обладающие наибольшей и наименьшей чувствительностью к антибактериальному веществу, и использовать их для проведения дальнейших экспериментов.

З А Н Я Т И Е 2

Изучение диализабельности антибактериальных веществ через целлофан и их чувствительности к ферментам

Техника. Половину стерильной чашки Петри с 1,5 % агаризованной глюкозо-солевой средой М9, покрывают стерильным целлофаном. Исследуемые штаммы бактерий (см. занятие 1) засевают штрихом непосредственно на поверхность целлофана и на поверхность агаризованной среды (контроль). Через 48 ч инкубирования при 28 ºС целлофан убирают, чашки обрабатывают парами хлороформа (30 мин), проветривают (60 мин) и наслаивают 4 мл 0,7 % глюкозо-солевой среды, содержащей 0,2 мл индикаторной культуры. Если образуемое антибактериальное вещество способно к диффузии через целлофан, то в месте, соответствующем росту бактериальной культуры на поверхности целлофана, формируется зона задержки роста бактерий индикаторной культуры.

Техника. Для определения чувствительности антибактериальных препаратов к действию ферментов используют засеянные медальонами на поверхность агаризованной 1,5 % среды штаммы-продуценты. Сфор-

97

мировавшиеся макроколонии обрабатывают парами хлороформа и заливают двумя слоями 0,7 % агаризованной среды М9. Первый слой содержит фермент в заданной концентрации (5 мкг/мл); второй – индикаторную культуру. Действие ферментов на антибиотики учитывают через 24 ч по величине зон задержки роста индикаторной культуры.

Задание 1. Сделать вывод о диализабельности антибактериальных веществ через целлофан.

Задание 2. Определить чувствительность антибактериальных веществ к гидролитическим ферментам.

З А Н Я Т И Е 3

Изучение антагонистического действия бактерий на фитопатогенные грибы и определение их фитотоксической активности

Техника. Исследуемые бактерии засевают пятнами на поверхность агаризованной среды М9 в чашках Петри и инкубируют в течение 24 ч при оптимальной температуре. После этого на расстоянии 1,5 см от сформировавшихся макроколоний методом укола в трех местах по окружности подсевают мицелий фитопатогенных грибов. В качестве контроля используют культуру бактерий E. coli. Засеянные чашки инкубируют при комнатной температуре в течение четырех суток. Антагонистическое действие учитывают по наличию зон задержки роста грибов.

Техника. Для изучения фитотоксической активности антибактериальных препаратов используется культура клеток зеленой водоросли Chlorella vulgaris 157, предварительно выращенная на поверхности скошенного агара среды М9; 2 мл такой взвеси вносят в 300 мл охлажденной до 46 ºС агаризованной среды М9 и разливают в чашки Петри. Исследуемые бактериальные культуры засевают «медальонами» по трафарету на поверхность среды. В качестве контроля используют культуру бактерий E. coli. Чашки инкубируют 24 ч в термостате при температуре, оптимальной для роста бактерий. После формирования бактериальных колоний чашки переносят в светотеплицу и инкубируют еще 72 ч для развития хлореллы. Учет результатов проводят по наличию зон задержки роста клеток хлореллы вокруг макроколоний исследуемых бактерий, что свидетельствует о продукции бактериями фитотоксических веществ.

98

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Задание 1. Определить чувствительность к антибактериальным препаратам некоторых штаммов грибов.

Задание 2. Определить чувствительность Chlorella vulgaris 157 к исследуемым антибактериальным препаратам.

З А Н Я Т И Е 4

Иодометрический метод определения пенициллиназной активности микроорганизмов

Взаимодействие бактериальной пенициллиназы с пенициллином, содержащимся в питательной среде (минимальной или полноценной), сопровождается расщеплением антибиотика с образованием 6-амино- пенициллановой кислоты, которая обеспечивает соединение крахмала с иодом.

Техника. Исследуемые культуры засевают бляшками диаметром 0,5–0,7 см на сектора в чашке Петри. Чашки инкубируют при оптимальной температуре в течение 18 ч. После этого на поверхность среды наливают 10 мл минимального 1,5 % агара с 0,5 % растворимого крахмала и пенициллином (5мг/мл) или любым другим антибиотиком, относящимся к группе β-лактамных. Чашки помещают на 1 ч в термостат при 37 ºС, после чего на поверхность среды наливают 5 мл раствора иода.

Учет результатов проводится через несколько минут после заливки иодом, который, соединяясь с крахмалом, вызывает развитие синего окрашивания среды. Вокруг макроколоний, продуцирующих пенициллиназу, образуются бесцветные кольцевидные зоны на синем фоне (положительный результат). Отрицательный результат – сохранение общефоновой синей окраски.

Задание 1. Определить наличие пенициллиназы у бактерий, несущих различные R-плазмиды.

Задание 2. Определить спектр действия образующегося фермента по отношению к различным β-лактамным антибиотикам.

З А Н Я Т И Е 5 Получение препаратов антибиотиков

Техника. Ночную культуру исследуемых штаммов, выращенную в жидкой питательной среде, разводят в 10 раз свежей средой и культивируют в течение 48 ч при 28 ºС с аэрацией, после чего центрифугируют

99