3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

Ингибиторы β-лактамаз делят на две группы: обратимые ингибиторы и необратимые инактиваторы. В основе механизма действия обратимых ингибиторов лежит конкурентное ингибирование. В этом случае изменяется лишь сродство фермента к субстрату-антибиотику: происходит преимущественное связывание с ингибитором, что препятствует связыванию с субстратом. По такому механизму действуют антибиотики, которые с очень малой скоростью гидролизуются соответствующей β-лактамазой. Например, для цефалоспрориназ класса С – это клоксациллин, широкого спектра действия – азтреонам.

В отношении некоторых β-лактамаз имеет место неконкурентное ингибирование. В этом случае ингибитор связывается с ферментом не в активном центре, а в другом участке. Такое ингибирование встречается относительно редко: например, ЭДТА, связывающая двухвалентные катионы, является неконкурентным ингибитором β-лактамаз класса В.

Необратимые инактиваторы вызывают потерю активности фермента, которая не восстанавливается после удаления избытка ингибитора. К ним относятся: модификаторы аминокислот, вещества, ингибирующие активный центр фермента, суицидные ингибиторы.

Модификаторы аминокислот – пара-хлор-ртуть бензоат (п-ХМБ) – ингибируют те β-лактамазы, у которых в активном центре важную роль играют остатки цистеина. Ингибиторами активного центра являются и вещества, сходные с субстратом, но имеющие высокоактивные группы. Они способны связываться с более чем одной аминокислотой в активном центре фермента и образовывать долгоживущие комплексы. Суицидные ингибиторы расщепляются при взаимодействии с ферментом за счет наличия высокоактивных групп, образуются ковалентные связи, и происходит инактивация фермента. К таким инактиваторам относятся клавулановая и оливановая кислота, сульбактам и др.

В качестве общих свойств ингибиторов β-лактамаз можно также рассматривать и следующее:

1)ингибитором может быть то соединение, чья фармакокинетика сходна с фармакокинетикой антибиотика, с которым она находится в комбинации;

2)не может быть создано ингибитора вообще, т. е. конкретное вещество действует на более или менее широкий круг лактамаз.

Создание комплексных препаратов, содержащих ингибитор β-лак- тамаз, является одним из перспективных направлений при оценке качества и расширения спектра новых β-лактамных антибиотиков. Среди других задач подобного рода особенно важна разработка препаратов с

51

расширенным спектром действия. Возникла данная проблема из-за возрастания в течение последних лет роли грамотрицательных бактерий в этиологии госпитальных инфекций, в появлении множественно резистентных штаммов и др. Этот процесс обусловлен совокупным действием ряда факторов: изменением нормальной микрофлоры человека под воздействием антибиотикотерапии вообще; применением лучевой терапии, цитостатиков, стероидных гормонов и других средств, снижающих реактивность больного организма.

Такими препаратами стали полусинтетические пенициллины и цефалоспорины. Предпосылки для их получения были созданы в 1959 году, когда Г. Бичем и К. Батчелор выделили ядро молекулы пенициллина – 6-ами- нопенициллановую кислоту (или Pen G), которая и послужила основой для синтеза препаратовс улучшенными свойствами.

Одно из требований, которое предъявляется к таким препаратам, – улучшенная проницаемость через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. К немаловажным свойствам можно отнести и повышение связывания с ПСБ. Наконец, некоторые фармакокинетические показатели: незначительное связывание с белками сыворотки крови, меньшая аллергенность, стабильность в кислой среде желудка, всасываемость при приеме внутрь – относятся также к существенным при оценке качества вновь созданных препаратов.

8. АНТИБИОТИКИ, ИНГИБИРУЮЩИЕ ПРОЦЕССЫ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА

Антибиотики, относящиеся к данной группе, весьма многочисленны и подавляют синтез белка за счет различных механизмов и на различных уровнях.

Условно их можно разделить на четыре группы:

1.Ингибиторы активации аминокислот и реакций переноса.

2.Ингибиторы функций малых субъединиц (30S) рибосомы.

3.Ингибиторы функций больших субъединиц (50S) рибосомы.

4.Ингибиторы внерибосомных функций.

Особенностями действия антибиотиков данной группы являются следующие:

1) временная остановка биосинтеза белка сама по себе не является летальной для клетки, поэтому антибиотики – ингибиторы биосинтеза белка обладают бактериостатическим действием, если только не связываются необратимо с какими-либо компонентами системы синтеза;

52

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

2)остановка биосинтеза белка имеет различные последствия для клеточного цикла: уже начавшийся цикл репликации ДНК продолжается, но новых циклов не инициируется, синтез РНК также продолжается в течение короткого промежутка времени, скорость синтеза клеточной стенки снижается и в конце концов прекращается;

3)биосинтез белка у про- и эукариот различается, поэтому может подавляться разными антибиотиками.

В качестве представителей антибиотиков первой группы можно рассматривать природные и синтетические аналоги аминокислот, подавляющие образование комплексов «ацилированная аминокислота – тРНК». Связываясь с тРНК, они могут включаться в полипептид, что приводит к образованию аномальных белков. К числу аналогов аминокислот можно отнести этионин, норлейцин, этилглицин, дигидропролин. Природными соединениями являются боррелидин и индолмицин, которые конкурентно подавляют связывание с аминоацил-тРНК треонина и триптофана соответственно. За исключением индолмицина, который является специфическим ингибитором прокариотической тРНК-синтетазы триптофана, остальные соединения действуют неспецифически и поэтому не нашли использования в клинике.

На стадии взаимодействия с пептидил-тРНК действует пуромицин. Это уникальный ингибитор белкового синтеза, так как он вступает в реакцию образования пептидной связи с С-концевым аминокислотным остатком растущей полипептидной цепи на рибосоме, что приводит к преждевременной терминации образования полипептида. Отмечено структурное сходство пуромицина и концевого аминоациладенозина в тРНК. Аминоациладенозин является концевым участком в тРНК как про-, так и эукариотических клеток, и действие пуромицина распространяется на клетки этих типов. Структурное сходство пуромицина и аминоациладенозина приводит к тому, что аминогруппа антибиотика образует пептидную связь с ацильной группой концевого аминоациладенозина пептидил-тРНК, связанной с рибосомой. Образование стабильного комплекса приводит к завершению образования пептидных связей и высвобождению пептидилпуромицина из рибосомы.

Аминогликозидные антибиотики, которых в настоящее время на-

считывается около сотни, по своей значимости занимают второе после

β-лактамных место. Относясь к антибиотикам с широким спектром действия, аминогликозиды используются для лечения таких инфекционных заболеваний, как туляремия, чума, коклюш, туберкулез. Стрептомицин может быть использован в сельском хозяйстве для борьбы с заболеваниями растений: бактериальным увяданием фасоли, ожогом косточковых. Антибиотики являются бактерицидными.

53

Первым обнаруженным представителем антибиотиков данной группы явился стрептомицин. Он был открыт в 1944 году С. Ваксманом, за что впоследствии (в 1952 году) ему была присуждена Нобелевская премия. С точки зрения химической структуры все соединения данной группы могут быть разделены:

1)на стрептомицины, имеющие в качестве агликонового фрагмента

стрептидин, не содержащий NH2-группу, которая замещена на гуанидиновую, и имеющие пентозы с разветвленной цепью;

2)2-ДОС (дезоксистрептамины) – в качестве агликонового фрагмента присутствует дезоксистрептамин, к которому гликозидной связью могут быть присоединены два сахара (пентозы и гексозы) по разным положениям;

3)фортамины, содержащие неизвестный ранее агликон, названный фортамином, и углеводный фрагмент;

4)сорбистины, содержащие нециклический агликон сорбитол и один углеводный фрагмент.

Таким образом, аминогликозиды – это соединения, содержащие аминосахара и сахара, соединенные гликозидной связью с агликоновым фрагментом. С другой стороны, в зависимости от устойчивости к действию инактивирующих ферментов, можно выделить аминогликозиды первого (стрептомицин, канамицин, неомицин, мономицин) и второго (гентамицин) поколений.

Для биолога исследование аминогликозидов может быть интересно со следующих позиций:

1)продукция данных антибиотиков наблюдается у представителей не менее шести различных родов бактерий, в частности у Pseudomonas,

Bacillus, Streptomyces, Micromonospora или других редких родов актино-

мицетов, что позволяет рассмотреть вопрос о локализации генов биосинтеза и биогенезе молекулы антибиотика;

2)структура молекулы предполагает широкие возможности для ее модификации, что используется в создании новых препаратов путем мутасинтеза;

3)именно для продуцентов стрептомицина обнаружен фактор А и установлена его регулирующая роль в процессах биосинтеза;

4)изучение функционирования рибосом и регуляция биосинтеза

белка;

5)изучение общих механизмов устойчивости, особенно за счет продукции инактивирующих ферментов, и создание антибиотиков, у которых экранированы подверженные их действию активные группы.

54

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Поступление в клетку аминогликозидов осуществляется с использованием пориновых каналов наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Это согласуется с тем, что аминогликозиды являются гидрофильными поликатионными соединениями, что облегчает их транспорт через заполненные водой каналы. Общим положительным зарядом молекулы объясняется также и способность некоторых аминогликозидов вытеснять из наружной мембраны катионы Mg2+, связывающие молекулы липополисахаридов. В результате этого частично дезорганизуется мембрана, что приводит к усилению поступления аминогликозидов через наружную мембрану. Такое явление получило название «самопромотирования», и в зависимости от роли, которую играют катионы Mg2+ в поддержании целостности наружной мембраны, для различных бактерий оно выражено в разной степени. Можно отметить, что высокие концентрации Mg2+ отрицательно сказываются на антимикробном действии аминогликозидов.

Поступление аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану является сложным, многоступенчатым процессом, идущим с затратами энергии. Его можно разделить на три фазы:

I – фаза связывания антибиотика с наружной поверхностью цитоплазматической мембраны (ионное связывание). Никакие механизмы резистентности клеток не влияют на ее осуществление;

II – фаза медленного поглощения, в результате которого через цитоплазматическую мембрану в клетку проникает незначительное количество антибиотика, не вызывающее летального исхода, но индуцирующее наступление фазы III;

III – индукция массивного поглощения антибиотика. Именно на этой стадии наступает летальный эффект для чувствительных клеток

(рис. 4).

Потребность в энергии на двух последних стадиях требует транспорта электронов по дыхательной цепи. Относительно веществ – переносчиков аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану в настоящее время сложилось устойчивое мнение, что это хиноны либо ка- кие-то связанные с ними вещества. По крайней мере для E. coli показано, что аминогликозиды в субингибирующих концентрациях блокируют функционирование цикла трикарбоновых кислот. Исходя из этого факта и объясняют отмеченное еще С. Ваксманом в 1950-х годах явление, которое заключается в том, что в аэробных и анаэробных условиях наблюдаются резкие различия в активности аминогликозидов по отношению к клеткам микроорганизмов. Клиницистам известна ре-

55

зистентность анаэробов (Clostridium, Bacteroides) и в некоторых условиях – факультативных анаэробов (Escherichia, Staphylococcus) к аминогликозидам. В среднем для лечения инфекций, развивающихся в анаэробных условиях, требуются примерно в десять раз большие концентрации антибиотиков. Причем такая резистентность не связана ни с изменением рибосом, ни с наличием инактивирующих ферментов. Считают, что в таких условиях не функционирует цикл трикарбоновых кислот, нет активных переносчиков аминогликозидов в клетку, а следовательно, и антибиотик в клетки не поступает. Такая ситуация, т. е. недостаток кислорода, наблюдается при развитии таких инфекций, как абсцессы и остеомиелиты.

Sm

полисома

Рис. 4. Поступление стрептомицина в клетки бактерий

56

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

С учетом механизма поступления аминогликозидов и того, что они действуют на процессы биосинтеза белка, создана единая концепция о действии аминогликозидов на бактериальную клетку. В основе такой концепции лежат исследования модельной системы «стрептомицин – E. coli».

Во время первой энергозависимой фазы незначительное количество стрептомицина проникает в клетку и взаимодействует с рибосомами на стадии элонгации белковой цепи. В результате ошибок считывания генетического кода образуются аномальные (или неправильные) клеточные белки с нарушенной последовательностью аминокислот, которые входят и в состав цитоплазматической мембраны. С их участием в мембране формируются неспецифические туннели, и в клетку поступают новые порции антибиотика, увеличивается количество ошибок считывания, повышается проницаемость мембраны, и количество поступающего антибиотика достигает той концентрации, когда белковый синтез блокируется уже на стадии инициации.

Высвобождение из клетки через образующиеся туннели низкомолекулярных метаболитов и неорганических ионов можно рассматривать как фактор, дополняющий летальное действие аминогликозидов. Также к летальному эффекту приводит и нарушение формирования точки начала репликации ДНК за счет образования аномальных белков на нижней поверхности цитоплазматической мембраны.

На молекулярном уровне действие аминогликозидов происходит следующим образом. Уже достаточно давно установлено, что мишенью их действия является процесс биосинтеза белка, а из клеточных структур – рибосомы. Здесь следует отметить, что стрептомицин действует на 30S субъединицу, другие аминогликозиды связываются с обеими субъединицами, в их присутствии образуется нестабильный 70S инициаторный комплекс и обрывается биосинтез белка.

В 1961 году было высказано предположение о влиянии стрептомицина на процессы биосинтеза белка. К тому времени была разработана бесклеточная система синтеза белка и уточнение сайта действия антибиотика проводили in vitro. В бесклеточную систему вводили стрептомицин и четыре возможных комбинации 30S и 50S субъединиц из рибосом чувствительных и устойчивых клеток, необходимые для осуществления биосинтеза белка составляющие. В результате было установлено, что ключевую роль в устойчивости играет 30S субъединица: если данная субъединица получена из резистентных клеток, то процесс биосинтеза белка происходит в присутствии антибиотика.

Дальнейшая диссоциация 30S субъединицы на 16S-рРНК и 21 белок определила, что ключевую роль играет одна из белковых молекул. Сравнение белковых профилей из устойчивых и чувствительных клеток позволило М. Номура в 1968 году выявить разницу в одном белке – Р10

57

(S12). Именно его структура определяет устойчивость к антибиотику. Различия между белком в чувствительных и устойчивых клетках сводятся к очень небольшому числу замен аминокислот: лизин в 42 положении может быть заменен на аспарагин, треонин или аргинин, а лизин в 87 положении – на аргинин.

Оказалось, что белок S12 в изолированном виде стрептомицин не связывает, а, по всей вероятности, контролирует такое связывание на рибосоме. Объяснили это следующим образом:

1)S12 при выделении изменяет конформацию;

2)S12 экранирует места связывания стрептомицина на рибосоме в устойчивых клетках;

3)S12 влияет на конформацию тех белков, которые реагируют со стрептомицином.

Ни одно из этих предположений не опровергнуто, и в настоящее время считают, что со стрептомицином связываются по крайней мере пять белков (S3, S5, S9, S12, S14) и 16S-рРНК. Каждая 30S субъединица рибосом связывает по одной молекуле антибиотика, образуя так называемое место «сильного» связывания. Кроме этого, отмечают, что в разных функциональных состояниях, в зависимости от температуры, концентрации катионов, рибосома может по-разному связывать антибиотик.

При связывании с рибосомой одно из следствий действия стрептомицина – возникновение ошибок считывания. Этот факт зарегистрирован и в системе in vivo, и в системе in vitro. В частности, в системе биосинтеза белка с поли-U как матрицей и в присутствии таких аминокислот, как фенилаланин, лейцин, серин, тирозин, при наличии стрептомицина наблюдается ошибочное включение лейцина вместо фенилаланина. Было установлено, что такое ошибочное считывание подчиняется нескольким закономерностям:

1)происходит при высокой концентрации магния и зависит от концентрации тРНК;

2)в любом кодоне мРНК ошибочно считывается одно основание,

обычно пиримидин, расположенный на 5′-конце или всреднем положении;

3)3′-основание считывается верно;

4)ошибки считывания пуринов происходят редко, и при их наличии

вкодоне вероятность ошибочного считывания резко снижается. Ошибочное считывание лежит в основе явления фенотипической

супрессии или подавления последствий мутации на уровне фенотипа. Мутанты такого типа названы «стрептомицинзависимые» или Smd.

Стрептомицин подавляет биосинтез белка монофазным путем: при увеличении концентрации синтез снижается практически до полной остановки. Относительно действия других аминогликозидов на клетки можно отметить, что мишень действия та же, однако связываться анти-

58

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

биотики могут с обеими субъединицами; одна субъединица может связать более одной молекулы антибиотика.

Следовательно, аминогликозидные антибиотики подавляют синтез белка трехфазным путем:

1)при низких концентрациях (порядка 2 мкг/мл) наблюдается общее подавление синтеза;

2)при более высоких (порядка 50 мкг/мл) синтез белка даже стимулируется;

3)при еще больших концентрациях процесс вновь подавляется.

В первом случае считают, что ошибки считывания незначительны; во втором – ошибки считывания существенны, особенно для терминирующих кодонов, что приводит к синтезу аномально длинных белковых цепей, и это фиксируется как увеличение синтеза белка. Наконец, в третьем – молекулы антибиотика способны связываться и занимать новые места на рибосоме.

Таким образом, можно сказать, что летальное действие аминогликозидов обусловлено подавлением диссоциации свободных рибосом; снижением точности трансляции; подавлением транслокации рибосом; подавлением терминации полипептидной цепи.

Устойчивость к аминогликозидам может быть обусловлена как мутациями, затрагивающими хромосомальные гены, так и наличием в клетке плазмид, и проявляется на нескольких уровнях:

•модификации рибосом, которая выражается в изменении или отсутствии белков для связывания антибиотиков – rpsL-мутация (S12) и rrs-мутация (16S-рРНК);

•снижение транспорта антибиотика в клетку, например, у анаэробных бактерий. В этом случае наблюдается одновременная устойчивость практически ко всем аминогликозидам;

•синтез ферментов, инактивирующих антибиотики, как правило, детерминируемый плазмидными генами. Такие ферменты не выделяются

всреду и локализованы на наружной поверхности цитоплазматической мембраны или в периплазме грамотрицательных бактерий, они требуют наличия кофакторов и нестабильны при выделении. Известны три типа таких ферментов: N-ацетилтрансферазы, О-фосфотрансферазы и О-аде- нилилтрансферазы. В каждом случае происходит взаимодействие фер-

мента с конкретной группой в молекуле антибиотика: NH2-группа может быть замещена на ацетильный остаток (кофактор АсКоА); ОН-группа – на остаток фосфорной или адениловой кислот (кофактор АТФ). В молекуле аминогликозидов три функциональные группы подвергаются ацетилированию, шесть – фосфоили аденилированию.

Фосфотрансферазы (АРН) в зависимости от положения атакуемой группы делятся на пять подгрупп, обозначаемых А, B, C, D, E. Среди

59