3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

• van Х, кодирующий специфическую гидролазу, гидролизующую димеры D-аланина, но не димеры D-аланина-D-лактата.

Благодаря работе этих генов резко сокращается содержание группировок D-аланин-D-аланин по сравнению с D-аланин-D-лактат (1: 49). В составе плазмиды имеются и регуляторные гены van S и van R. Белок Van S располагается в мембране, а его внутренний участок способен фосфорилироваться в цитоплазме при участии АТФ в результате воздействия на наружную часть внешнего сигнала. Подобный процесс приводит к передаче сигнала на белок Van R, который связывается с промоторным участком ДНК перед геном van H, и запускает транскрипцию всех остальных. В качестве внешнего стимула выступает не сам антибиотик, а процесс подавления реакций трансгликозилирования и транспептидации.

Во-вторых, резистентность, связанная с доступностью мишени, обнаружена у Staphylococcus. Клетки с таким типом резистентности характеризуются более толстыми стенками, имеющими иррегулярную структуру, на них хуже адсорбируются некоторые бактериофаги, они более устойчивы к лизоциму. Анализ белков клеточной стенки показал, что содержание одного из пенициллинсвязывающих (РВР-2) белков сильно повышено и обнаружены два новых белка – 35 и 39 Кд, с которыми и связывают устойчивость.

Антибиотики β-лактамные являются, пожалуй, самыми широко распространенными в лечебной практике. Они используются для лечения ряда заболеваний и активны в отношении многих возбудителей, так как обладают широким спектром антимикробного действия, высокой активностью, стабильностью и эффективностью. Продуцентами β-лак- тамных антибиотиков являются грибы Penicillium chrysogenum (пенициллины) и Cephalosporium acremоnium (цефалоспорины). Общим свойством антибиотиков данной группы является наличие в молекуле β-лак- тамного кольца, а в биологическом смысле – механизм антимикробного действия. В лечебной практике используется около 50 различных препаратов группы пенициллинов. Современная их классификация является комплексной, учитывает как химические особенности, так и спектр действия и выглядит следующим образом:

1.Природные пенициллины (бензилпенициллин, бициллин и др.).

2.Полусинтетические пенициллины:

а) активные в отношении преимущественно грамположительных бактерий, устойчивые к пенициллиназе (оксациллин);

б) широкого спектра действия (ампициллин, карбенициллин и их производные);

40

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

в) антипсевдомонадные (азлоциллин, мезлоциллин); г) активные в отношении преимущественно грамотрицательных

бактерий.

3. Структурно близкие к пенициллинам соединения: а) ингибиторы β-лактамаз; б) карбапенемы (имипенем, тиенам); в) монобактамы (азтреонам).

Препараты группы цефалоспоринов, обнаруженные в 1945 году (в настоящее время используется в клинике около 30), классифицируются с учетом последовательности их внедрения в практику, спектра действия и делятся на поколения:

I – антибиотики с антистафилококковой, антистрептококковой и антигонококковой активностью (цефалоридин, кефзол, цефалексин);

II – обладающие дополнительной активностью в отношении эшерихий, клебсиелл, протеев (клафоран);

III – проявляющие активность в отношении большого числа грамотрицательных бактерий, в том числе и P. aeruginosa (цефокситин, цефобид);

IV – проявляющие активность в отношении грамположительных кокков, а также многих штаммов кишечных бактерий и псевдомонад (цефпиром, цефипим).

Все β-лактамные антибиотики являются бактерицидными. Между собой они различаются по способности всасываться, используемым дозам, фармакокинетическим показателям, способам применения и т. д.

Еще в 1960-х годах (на модельной системе Staphylococcus aureus) было показано, что мишенью действия пенициллина являются ферменты, обеспечивающие образование клеточной стенки бактерий. Единственной приемлемой стала гипотеза о сходстве между молекулой фермента транспептидазы и молекулой пенициллина. Вероятно, пенициллин связывается с активным центром фермента транспептидазы, ацилирует его и блокирует доступ для субстрата. Высвобождение молекулы пенициллина из комплекса происходит крайне медленно, в то время как природный субстрат (пентапептид) высвобождается быстро. Установлено сходство между пространственной ориентацией атомов и полярных групп пенициллинового ядра и одной из конформаций остатков D-аланина-D-аланина, причем такое сходство устанавливается при взаимодействии с ферментом. β-Лак- тамные антибиотики действуют и на карбоксипептидазы, удаляющие свободные остатки D-аланина, однако такое действие не является для клетки летальным.

41

Рассматривая действие β-лактамных антибиотиков на клеточную стенку, а также анализируя возможные механизмы устойчивости к ним, следует отметить и роль так называемых пенициллинсвязывающих белков (ПСБ, PBP”s). Открыты эти белки были собственно по способности связываться с меченым пенициллином, а также конъюгатами пенициллина и сывороточных белков.

ПСБ локализованы в цитоплазматической мембране, по своей активности относятся к ферментам классов транспептидаз и D-аланин- карбоксипептидаз. Основная их роль – участие в процессах синтеза клеточной стенки, формообразовательных процессах в клетке и ее физиологическом цикле. Разные типы ферментов включены в увеличение длины, приобретение формы, образование перегородки клетки. Считается, что типов ПСБ меньше у кокков, нежели у палочек: у E. coli – 9, S. aureus – 2–4, B. subtilis – 7–8. Количество молекул на клетку составляет у E. coli – 2000–3000 или примерно 1 % от всех мембранных белков.

ПСБ доступны для антибиотика, так как они располагаются частично в мембране, частично – в периплазме грамотрицательных бактерий или на границе мембрана – среда. Сигнальной частью пептид заякорен в мембране (у ПСБ-1 E. coli – это остатки с 64 по 87), с 88 по 844 находятся в периплазме. Такое расположение связывают с тем, что активный центр транспептидаз захватывает структурные единицы пептидогликана и включает их в полимер. Степень необходимости тех или иных ПСБ для клеток различается, что означает наличие существенных и менее существенных. Например, у S. aureus из четырех ПСБ существенными являются только второй и третий, дефекты в белках 1 и 4 не являются летальными для клетки. У S. faecalis – шесть ПСБ, однако существенными являются только три из них. Важно отметить, что при действии пенициллинов и разрушении существенных белков несущественные могут выполнять функции последних.

Наиболее полно изученными являются ПСБ у E. coli. В табл. 7 представлены свойства некоторых из них.

Белки ПСБ 1А и ПСБ 1В рассматривались ранее как один белок, однако в последние годы показано, что они кодируются отдельными генами, локализованными на 3-й и 73-й минутах карты. Неодинаковы и условия их функционирования: потребность в катионах (Mg2+), сродство к отдельным лактамным антибиотикам. Их основная роль – элонгация пептидогликана, и обладают они бифункциональной активностью (наращивание полисахаридной цепи и замыкание мостиков пептидов), хотя трансгликозидазная функция и не чувствительна к действию пенициллинов.

42

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Таблица 7

Свойства некоторых пенициллинсвязывающих белков Escherichia coli

ПСБ 2 также бифункционален, за счет его активности клетка приобретает очертания, формируются ее полюса. Инактивация белка приводит к образованию сферических, но осмотически стабильных и маложизнеспособных клеток. При изменении белка ПСБ 3 образуются филаменты, или нитевидные клетки, следовательно, он участвует в образовании клеточной перегородки и клеточном делении.

Проявление резистентности к β-лактамным антибиотикам на уровне ПСБ – многоступенчатый процесс. При этом происходит поочередное изменение чувствительности белков к антибиотикам: вначале легко насыщается (связывается) наиболее чувствительный белок, при устойчивости клеток он становится мутантным, затем – второй по чувствительности и т. д. При таком механизме резистентность не может быть достигнута за счет одной мутации.

Действие β-лактамных антибиотиков на клетку может привести к литической и нелитической гибели. Кроме того, было отмечено такое свойство, как толерантность клеток. Ранее считалось, что пенициллины и цефалоспорины могут вызывать только лизис, однако в настоящее время

43

обнаружено множество видов, штаммов, мутантов бактерий, чей рост ингибируется β-лактамными антибиотиками, но микроорганизмы в течение длительного времени не лизируются. Нелитическая гибель – свойство некоторых микроорганизмов терять жизнеспособность, но не лизироваться быстро при контакте с антибиотиком. Под толерантностью (бактериостазом) понимают специфическое свойство микробной клетки к сохранению жизнеспособности в течение длительного контакта с антибиотиком за счет существенных дефектов метаболизма, которые играют, однако, в его присутствии положительную роль.

Реализация того или иного последствия ингибирования синтеза пептидогликана под действием антибиотика зависит от нескольких факторов в процессе клеточного цикла. В зависимости от стадии роста клетки различается активность ферментов синтеза клеточной стенки, например пептидогликангидролазы (с эндопептидазной и гликозидазной активностью), участвующей в разрушении клеточной стенки при росте за счет освобождения мест для «застройки» и включения новых единиц пептидогликана. У S. aureus и E. coli аутолитическая активность ферментов сильно возрастала через 20 мин после начала репликации ДНК и снижалась через 30 мин. Первое время соответствует периоду образования клеточной перегородки и клеточному делению.

Характерным на разных стадиях клеточного цикла является и содержание различных типов ПСБ. Для E. coli при переходе в стационарную стадию роста уменьшалось связывание меченого ампициллина с ПСБ 1, 2, и 3, а связывание с ПСБ 4 и 5 увеличивалось в 4–10 раз. При разбавлении такой культуры процесс происходил в обратном направлении. Считается, что, если антибиотик ингибирует клеточное деление на стадии, когда аутолитическая активность высока, происходит лизис клетки; если такая активность подавлена или отсутствует – нелитическая гибель или бактериостаз. При этом в последнем случае антибиотик должен действовать таким путем или в такое время клеточного цикла, когда он приводит к несбалансированному росту и неспособности клеток делиться.

Толерантные формы, например, дефектны по синтезу гидролазы пептидогликана: в этом случае и мутантные формы, и бактерии дикого типа обладали одинаковой МИК, но в первом случае лизиса не наблюдалось. Кроме этого, толерантность может быть обусловлена:

1)пониженным содержанием аутолизинов;

2)более высокой способностью к синтезу ингибиторов аутолизинов

идр. Например, у Streptococcus pneumoniae описан так называемый «форссмановский антиген», липидтейхоевая кислота, расположенная в

44

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

цитоплазматической мембране и клеточной стенке. Под действием пенициллина он может высвобождаться и ингибировать активность одного из основных аутолитических ферментов – амидазы. Многие хронические заболевания обусловлены наличием толерантных форм, например эндокардиты.

ПСБ играют определенную роль в случае спорогенеза, обеспечивая переход от палочковидной клетки к сферической споре. При этом могут образовываться новые ПСБ или наблюдаться протеолитическая модификация уже имеющихся. Последние выводы показаны для бацилл, у которых аспорогенные мутанты содержали примерно вдвое меньше ПСБ, а в мембранах предспоры обнаруживались новые ПСБ.

Роль ПСБ в развитии устойчивости к пенициллинам и цефалоспоринам, можно сказать, весьма незначительна, что связано с необходимостью множества мутаций для перевода всех ПСБ в сосотояние пониженной аффинности к антибиотикам. Однако существуют некоторые исключения, которые оказываются весьма важными для химиотерапии и клиники. Речь идет о MRSA (метициллинрезистентность различных видов стафилококков). В этом случае в мембране устойчивых клеток появляется новый белок – ПСБ2а, который перекрывает функции всех остальных инактивируемых метициллином белков. Отмечается, что детерминируют метициллинрезистеность гены mec, которые имеют размер 37 кб. Помимо структурного гена во фрагменте содержится информация о регуляции экспрессии гена, ген транспозазы, гены устойчивости к другим антибиотикам и ионам тяжелых металлов. Транспозон обозначен Tn 4291.

В качестве основного механизма резистентности к β-лактамным антибиотикам рассматривают продукцию ими β-лактамаз – ферментов, гидролизующих амидную связь в молекулах пенициллинов, цефалоспоринов, пенемов и монобактамов. Обнаружены эти ферменты были Ф. Абрахамом и А. Чейном практически сразу после внедрения в клиническую практику пенициллина в 1940 году. С тех пор интерес к ним чрезвычайно возрос, поскольку в 1948 году были устойчивы к β-лактамам менее 50 % выделенных штаммов, а в середине 1950-х годов – уже 80 %. Данные о распространении различных типов резистентности к β-лактам- ным антибиотикам у различных групп организмов представлены в табл. 8.

В общем виде в зависимости от субстратного профиля все β-лак- тамазы делят на три группы: пенициллиназы (активные преимущественно в отношении пенциллинов); цефалоспориназы (активные в отношении преимущественно цефалоспоринов) и β-лактамазы широкого спектра действия, обладающие примерно равной активностью в отношении обеих групп антибиотиков (активности не отличаются более чем на 30 %).

45

Таблица 8

Механизмы резистентности к β-лактамным антибиотикам у бактерий

Обнаруживаются β-лактамазы в цитоплазматической мембране как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. У первых они выделяются дополнительно в окружающую среду, у вторых – в периплазматическое пространство. Более высокая каталитическая активность β-лактамаз грамположительных бактерий объясняется строением клеточной стенки: пептидогликан непосредственно соприкасается с окружающей средой, и молекулы антибиотика могут быть инактивированы только β-лактамазами с высокой удельной активностью, работающими в большом объеме среды. У грамположительных бактерий хорошо изучены данные ферменты у стафилококков и бацилл. После индукции синтеза количество фермента может достигать 0,1 % от всего белка.

У грамотрицательных бактерий β-лактамазы обнаруживаются, за небольшим исключением, в периплазматическом пространтстве. Известны лишь несколько случаев обнаружения внеклеточных β-лактамаз, например у нейссерий. Считается, что в периплазме β-лактамазы располагаются упорядоченно вокруг пориновых каналов, что усиливает эффективность их действия. Количество β-лактамаз у грамотрицательных бактерий – около тысячных долей процента.

Характеризуя β-лактамазы с физико-химической точки зрения, сразу же отмечают их субстратный профиль: наиболее легко гидролизуемым субстратом является для них бензилпенициллин, и в большинстве случаев активность β-лактамаз по отношению к другим антибиотикам выражают в процентах от их активности к бензилпенициллину. Субстратный профиль определяют двумя способами – спектрофотометрически и иодометрически. В первом случае судят об уменьшении содержания антибиотика в реакционной смеси по скорости его гидролиза; во втором – выявляют продукты гидролиза, пенициллоиновые и цефалоспороиновые кислоты (по образованию окрашенных продуктов с иодом). Практически все β-лактамазы не имеют четвертичной структуры, т. е. состоят из од-

46

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ной полипептидной цепи, имеют молекулярную массу от 20 до 40 Кда, изоэлектическую точку – от 5 до 9.

β-Лактамазы могут быть как металлозависимыми, так и сериновыми протеазами. В зависимости от этого они представлены четырьмя классами. Ферменты класса А имеют в активном центре ключевой остаток серина в 70-м положении и не менее четырех высококонсервативных аминокислотных последовательностей. По субстратному профилю это пенициллиназы или ферменты, обладающие широким спектром действия. Ферменты класса С характеризуются иной последовательностью аминокислот в активном центре и относятся к цефалоспориназам. К классу Д относят ферменты, обладающие активностью в отношении оксациллина и клоксациллина. Наконец, металлозависимые ферменты класса В сильно отличаются как друг от друга, так и от сериновых протеаз. Их активность зависит от наличия двухвалентных катионов, обычно Zn2+. Также они характеризуются исключительно высокой активностью в отношении ряда новых антибиотиков. В целом при создании системы классификации β-лактамаз учитывают:

•их субстратную специфичность;

•чувствительность к ингибиторам β-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам);

•локализацию генов синтеза (плазмидная или хромосомальная);

•изоэлектрическую точку;

•чувствительность к ЭДТА.

Рассматривая механизм действия β-лактамаз, считают, что при связывании с субстратом-антибиотиком конформация фермента меняется на более компактную. В результате взаимодействия гидроксильной группы сериновых протеаз с карбонильной группой β-лактамного кольца происходит его разрыв и образование ацил-ферментного комплекса. Далее он гидролизуется, и продукт расщепления антибиотика высвобождается из комплекса. В течение 1 с одна молекула фермента способна разрушить до 1000 молекул антибиотика.

Синтез β-лактамаз может детерминироваться генами, локализованными как в составе хромосомы, так и плазмиды. Причем одновременно в клетке могут присутствовать детерминанты обоих типов. Если учесть, что кодируемые ими ферменты существенно различаются по субстратному профилю и другим свойствам, то нетрудно объяснить одновременную устойчивость клеток к широкому кругу β-лактамных антибиотиков. Сравнивая активность β-лактамаз, детерминируемых плазмидными и хромосомальными генами, отмечают, что в случае детерминант, локали-

47

зованных на плазмидах, кодируемые ими ферменты активны в отношении более широкого круга соединений, вырабатываются в высоких концентрациях и являются общими для различных видов. Ферменты же, детерминируемые хромосомальными генами, гидролизуют либо пенициллины, либо цефалоспорины, вырабатываются в невысоких концентрациях, но индуцибельны, имеют тенденцию к видоспецифичности.

Хромосомально локализованные гены синтеза β-лактамаз обнаружены практически у всех патогенных бактерий. β-Лактамазы могут продуцироваться как конститутивно (E. coli, Proteus, Shigella), так и индуци-

бельно (Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Pseudomonas). Индукторами синтеза служат β-лактамные антибиотики в субингибирующих концентрациях (4–40 мкг/л), причем продукция β-лактамаз может увеличиваться в сотни и тысячи раз. В настоящее время рассматривают два возможных механизма индукции синтеза β-лактамаз антибиотиками:

1) первый заключается в том, что антибиотик взаимодействует с трансмембранным белком, С-концевой участок которого расположен на наружной стороне мембраны, имеет аминокислотные последовательности, сходные с β-лактамазой и ПСБ. Взаимодействие такого белка с антибиотиками и служит сигналом к синтезу β-лактамаз. Белок такого типа, кодируемый геном blaR1, обнаружен у B. lichiniformes. Белок 53 Кда (ген ampG) Citrobacter freundii выполняет ту же функцию. Если клонировать структурный ген β-лактамазы ampC без гена ampG в E. coli, индукции синтеза β-лактамазы не наблюдается;

2) другим сигналом может быть накопление клеткой избытка предшественников клеточной стенки, которые образуются при действии β-лактам- ных антибиотиков. Это подтверждается тем, что при клонировании β-лак- тамазных генов их индукция наблюдалась только в нормальных клетках, а не в L-формах.

Индуцибельные опероны расположены в клетках некоторых энтеробактерий и псевдомонад рядом с геном фумаратредуктазы. Между генами frd и ampC располагается регуляторный ген ampR. Эти гены транскрибируются в противоположных направлениях с перекрывающихся промоторов. В регуляции синтеза β-лактамаз принимает участие и ген ampD, продуктом которого является белок 25 кДа, репрессирующий синтез β-лактамаз. Продукт гена ampR связывается с промотором, прилегающим к гену ampC, и способствует его транскрипции. Продукт гена ampD либо разрушает индуктор, который после связывания с белком ampR связывается с ДНК, либо ampD белок образует комплекс с ДНК, который разрушается после действия индуктора.

48

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Классической, кодируемой плазмидными генами в составе Tn1 (А) является β-лактамаза, которая обнаруживается у плазмид не менее восьми различных групп несовместимости. Наиболее распространенными являются также ферменты типа ТЕМ (80 % плазмидных β-лактамаз, 21 тип), SHV (5 % плазмидных β-лактамаз, 5 типов). Относятся они к классу А и являются ферментами широкого спектра действия. Между собой различные типы ферментов различаются незначительным числом (1–4) аминокислотных замен.

Начиная с 1975 года описано не менее 7–8 различных классификаций β-лактамаз. В табл. 9 представлена современная классификация β-лак- тамаз с учетом последних данных.

Поскольку устойчивость бактерий к β-лактамным антибиотикам практически полностью обеспечивается продукцией β-лактамаз, то одной из задач и одним из направлений поиска новых препаратов явилось исследование ингибиторов β-лактамаз. Такие соединения были обнаружены в 1960-х годах, и исследования показали, что они могут быть как синтетическими, так и природными соединениями. Эффект проявления ими активности как собственно β-лактамных антибиотиков наступает при очень высоких концентрациях, которые не могут иметь терапевтического значения. Из культуральной жидкости после выращивания бактерий Streptomyces olivaceus и Streptomyces clavuligerus были выделены оливановая и клавулановая кислоты, которые обладали способностью инактивировать β-лактамазы на фоне низкой антибиотической активности. Например, клавулановая кислота отличается от бензилпенициллина замещениями по двум положениям, а оливановая имеет заменуатома серы на углерод.

Взаимодействуя с ферментом, на начальной стадии ингибитор распознается им как субстрат (антибиотик) и связывается с активным центром β-лактамаз. Затем происходит гидролиз ингибитора по β-лактамной связи. Специфическая активность ингибитора определяется длительностью существования ацил-ферментных промежуточных соединений. Образование комплекса фермент – ингибитор часто имеет необратимый характер, и активность фермента не восстанавливается. В таком случае ингибиторы носят название «прогрессивных» (клавулановая кислота). В клинике предложено использовать ее в комбинации с амоксициллином 1: 2 (препарат аугментин). Синтетическое соединение сульбактам в комплексе с ампициллином было названо уназин. Препараты, в которых содержатся одновременно β-лактамный антибиотик и ингибитор β-лакта- маз, получили название «потенцированных».

49