3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

45 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают хлороформом (1 % по объему) и титруют методом критических разведений. Для этого препарат антибиотика двукратно разводят физиологическим раствором и по 0,2 мл смеси наносят в лунки на газон чувствительной культуры. Чашки инкубируют в течение 24 ч при 28 ºС.

Учет результатов проводят по наличию зон задержки роста клеток индикаторных бактерий, что свидетельствует о продукции бактериями антибиотических веществ и выражают в условных единицах, соответствующих значениям последних разведений, обусловливающих формирование четких зон ингибирования роста индикаторной культуры.

Задание. Выявить штаммы бактерий, продуцирующие антибиотические вещества в культуральную жидкость, и выразить их антибактериальную активность в условных единицах.

З А Н Я Т И Е 6 Определение принадлежности веществ

к соответствующим группам антибиотиков

Используя приведенные качественные реакции, определить принадлежность веществ к группам антибиотиков в зависимости от механизмов действия, химической структуры и т. д. в соответствии с полученным вариантом задания.

•Эритромицин. К 0,1 г (или 0,1 мл раствора) прибавляют 0,5 мл ацетона и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. Появляется оранжевое окрашивание, постепенно переходящее в темно-красное. Затем добавляют 1 мл хлороформа и взбалтывают. Хлороформный слой окрашивается в фиолетовый цвет.

•Тетрациклин.

1)К пяти каплям раствора (0,5 %) добавляют одну каплю 5 % спиртового раствора хлорного железа. Появляется коричневая окраска.

2)К 5–10 мг порошка прибавляют 10 капель концентрированной серной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет.

• Пенициллин.

1) К 5–6 каплям водного раствора антибиотика (5–10 мкг/мл) прибавляют одну каплю реактива, состоящего из 1 мл 1 М раствора гидроксиламина солянокислого, и 0,3 мл 1 М раствора гидроксида натрия. Через 2–3 мин добавляют одну каплю 1 М раствора уксусной кислоты и после перемешивания одну каплю раствора нитрата меди (5 %). Через одну минуту образуется зеленый осадок.

100

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

2)К пяти каплям антибиотика добавляют две капли 5 % раствора гидроксиламина. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения прибавляют одну каплю 5 % раствора хлорного железа. Появляется розовое или красное окрашивание.

3)К двум каплям раствора пенициллина добавляют две капли концентрированного раствора едкого натрия и кипятят 1–2 мин. После охлаждения добавляют по каплям 5 % раствор нитропруссида натрия. Наблюдают появление красного окрашивания, переходящего в оранжевое и желтое.

• Ампициллин.

1) 0,02 г ампициллина растворяют в 2 мл воды, прибавляют 2 мл свежеприготовленного 0,25 % нингидрина и кипятят 2–3 мин. Появляется вишневое окрашивание.

2). 0,01 г порошка растворяют в 1 мл воды и прибавляют 1 мл реактива Феленга, сразу же появляется фиолетовое окрашивание.

• Цефалоспорины.

1) К 20 мг вещества прибавляют несколько капель 80 % раствора серной кислоты, содержащей 1 % азотной кислоты. Появляется желтое окрашивание.

2) К 20 мг вещества прибавляют пять капель 1 % уксусной кислоты, две капли 1 % раствора сульфата меди и одну каплю 2 н раствора едкого натра. Образуется оливково-желтое окрашивание.

• Стрептомицин.

1)Реакция на гуанидиновую группировку. К трем каплям 1 % водного раствора стрептомицина добавляют три капли 10 % едкого натра, три капли 0,1 % спиртового раствора α-нафтола и 3–9 капель 2 % свежеприготовленного раствора гипобромида натрия. Жидкость окрашивается

вкрасный или розовый цвет.

2)К 5–6 каплям исследуемого раствора (0,5 %, или 5–10 мкг/мл) прибавляют 2–3 капли раствора 10 % раствора гидроксида натрия и нагревают на водяной бане 3 мин. После охлаждения добавляют 5–6 капель разведенной (10 %) серной кислоты и 2–3 капли раствора хлорного железа (3 %). Появляется красно-фиолетовое окрашивание.

3)К 5-6 каплям раствора прибавляют 0,5 мл раствора хлорида бария (5 %). Образуется белый осадок, не растворимый в разведенных минеральных кислотах.

• Сульфаниламиды.

1) К 0,05 г порошка прибавляют по 4–5 капель воды и разведенной соляной кислоты, 5–6 капель 0,1 М раствора нитрита натрия и 4–6 капель раствора аммиака. Появляется оранжево-красное окрашивание.

101

2)К 0,1 г порошка прибавляют 1 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия, взбалтывают 1 мин и фильтруют. К фильтрату добавляют 5–6 капель раствора сульфата меди. Образуется осадок различных цветов: у норсульфазола – грязно-фиолетовый; у этазола – травянисто-зеленый; у сульфадимезина – желтовато-зеленый.

•Стрептоцид. К 1 мл раствора прибавляют 5–6 капель разведенной соляной кислоты, 2–3 капли 0,1 % нитрита натрия и к 0,1 мл полученной смеси добавляют 1–2 мл щелочного раствора нафтола. Появляется виш- нево-красное окрашивание.

•Левомицетин.

1)К 0,5 мл раствора (0,015 %) прибавляют 1–2 мл разведенной соляной кислоты, 0,1 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане 2–3 мин. После охлаждения раствор фильтруют. К фильтрату добавляют 2–3 капли 0,1 М раствора нитрита натрия и 0,3–0,5 мл полученной смеси вливают в 1–2 мл раствора β-нафтола, приготовленного на 10 % растворе натрия гидроксида. Появляется розовое окрашивание.

2)10 мг левомицетина встряхивают с 1 мл 5 % раствора сульфата меди (II), добавляют 1 мл раствора гидроксида натрия и встряхивают

1мин. Появляется синий осадок.

•Салициловая кислота. К 4–5 каплям раствора прибавляют две капли раствора (3 %) окисного железа хлорида. Появляется сине-фиоле- товое окрашивание.

•Гентамицин. К 1 мл раствора антибиотика (5–10 мкг/мл) прибавляют 0,2 мл 0,2 М раствора гидроксида натрия, нагревают 10 мин на водяной бане и охлаждают 3 мин под струей холодной воды. Затем добавляют 0,8 мл 1 % раствора железоаммониевых квасцов в 0,275 М растворе серной кислоты и перемешивают. Регистрируют изменение окраски.

•Линкомицин. В пробирку с притертой пробкой отбирают 1,5 мл исследуемого раствора антибиотика, добавляют 0,05 мл насыщенного раствора углекислого натрия, 0,15 мл разведенного (1:1) реактива Фолина и нагревают на водяной бане в течение 15 мин. Раствор охлаждают и хорошо перемешивают. О наличии антибиотика свидетельствует развитие синего окрашивания.

•Нистатин. К 0,05 г порошка прибавляют 1–2 мл ледяной уксусной кислоты и 5–6 капель 0,1% раствора перманганата калия. Раствор быстро обесцвечивается.

102

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Результаты работы представляют в виде таблицы:

В а р и а н т 1

Определить каждый из β-лактамных антибиотиков.

В а р и а н т 2

Определить каждый из антибиотиков – ингибиторов биосинтеза белка.

В а р и а н т 3

Выявить противогрибковый антибиотик и антибиотики с антиметаболической активностью.

В а р и а н т 4

Выявить: полусинтетический β-лактамный антибиотик; антибиотик из группы дезоксистрептаминов; соединение с противовоспалительной активностью.

103

ПРИЛОЖЕНИЕ

Структурные формулы некоторых антибиотиков

Leu DABA

D-Phe DABA

DABA Thr

DABA CO (CH3)4CH

CH3

1. Структурная формула полимиксина В. DABA – 2,4-диаминомасляная кислота

D-val

D-Hiv

val lac

2. Структурная формула валиномицина.

Lac – молочная кислота; Hiv – 2-гидрооксиизовалериановая кислота

3. Структурная формула амфотерицина В

105

4.Структурные формулы пенициллинов (а), цефалоспоринов (б), пенемов (в)

имонобактамов (г). Стрелками указаны места действия ацилаз и β-лактамаз

H

C H

CH3 O C

PO3H2

а

H

O

N NH2

O

б

5. Структурная формула фосфомицина (а) и D-циклосерина (б)

106

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

107

a m in o h ex o s e

N H 2

д

CH2NH2

aminohexose CH2

H2C NH2

е

6.Строение природных аминогликозидных антибиотиков.

а– стрептомицин; б, в, г – группа дезоксистрептаминов (неомицины, канамицины, бутирозин); д – фортамины; е – сорбистины

7. Канамицин как субстрат инактивирующих аминогликозиды ферментов. Стрелками указаны функциональные группы, подвергающиеся ферментативной инактивации

108

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/