3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

антибиотиков в чистом виде появилась возможность выразить их биологическую активность в единицах массы. Для многих антибиотиков (эритромицин, нистатин, трихоцетин и др.) 1 ед. активности соответствует 1 мкг вещества. В других случаях это соотношение может отличаться: 1 мг чистого основания неомицина содержит 300 ед. активности. В табл. 1 приведены некоторые из этих величин.

Таблица 1

Соотношение единиц действия и единиц массы некоторых антибиотиков

Во взаимодействии микроб – антибиотик полное ингибирование роста, которое характеризуется МИК, встречается не всегда, другие варианты возможны при субингибирующих концентрациях, т. е. находящихся в пределах от 0 до 1 МИК. При таких концентрациях антибиотика характер роста микроорганизмов может в течение определенного времени замедляться с последующим восстановлением. Изучение кинетики антимикробного действия такого типа послужило основанием для введе-

ния нового показателя – минимальной антибиотической концентрации

(МАК), за которую принимается концентрация антибиотика, вызывающая изменение структуры клеток бактерий или скорости их роста, или того и другого одновременно. Выделяют МАК ультраструктуры, т. е. морфологические изменения клеток, и МАК ингибирования, т. е. изменение плотности микробной популяции за время наблюдения на 1 lg.

К характеристикам антибиотической активности относится и такая,

как спектр антибиотической активности (действия) – группа организ-

мов, рост которых подавляется данным соединением.

Различная активность антибиотиков в отношении микро-, а также макроорганизмов может быть связана с разными факторами.

Во-первых, она зависит от различной проницаемости клеточных оболочек для поступления антибиотиков. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий устроена более сложно, нежели грамположительных, из-за наличия наружной мембраны. Вероятно, именно это привело к то-

10

му, что последние в норме более чувствительны к большинству антибиотиков. Если же у грамотрицательных бактерий удалить наружную мембрану, то чувствительность к антибиотикам изменится. Устойчивость грамотрицательных бактерий за счет наличия наружной мембраны носит название intrinsic, что значит «природная, естественно присущая».

Во-вторых, поступая в клетку, антибиотик должен проникнуть через липофильную наружную и внутреннюю мембраны, гидрофильный пептидогликан и попасть в гидрофильную цитоплазму. В этом случае говорят о том, что степень гидрофильности антибиотика должна быть подходящей. В зависимости от этого свойства может быть задействовано несколько механизмов поступления антибиотиков, в том числе – активный и пассивный транспорт, использование транспортных систем для других соединений.

Действие антибиотиков на бактериальные клетки определяется их способностью проникать через наружную мембрану. Основные сведения о структуре наружной мембраны были получены в 70–80-х годах ХХ столетия и касались в основном представителей кишечной группы бактерий и псевдомонад. Основными компонентами наружной мембраны являются липополисахариды (ЛПС), фосфолипиды, липопротеины и мембранные белки. Наружная и внутренняя поверхность мембраны асимметричны: наружная часть представлена преимущественно ЛПС и белками, внутренняя – фосфолипидами и белками. Каждое из этих соединений отдельно и все вместе могут либо способствовать (или обеспечивать), либо препятствовать поступлению антибиотиков.

ЛПС-компоненты наружной мембраны связаны между собой через катионы Mg2+. Удаление этих катионов усиливает отталкивание между соседними участками (молекулами) ЛПС и ЛПС и кислыми белками, вследствие этого обнажаются участки поверхности, и их место могут занимать фосфолипиды из нижнего слоя и облегчать поступление гидрофобных (липофильных) веществ. Доказательством тому, что ЛПС и липиды могут быть связаны с поступлением антибиотиков в клетку (например, β-лактамных), является то, что чувствительность к ним возрастает после обработки ЭДТА. Кроме того, известны так называемые «шероховатые» (deep rough) мутанты, которые характеризуются изменением ЛПС за счет укорочения полисахаридной части молекулы, что усиливает поступление гидрофобных веществ. В качестве примера можно рассматривать и повышенную чувствительность N. gonorrhaeae к β-лактамам. Показано, что отношение липидов к белкам в их мембране гораздо ниже (примерно в 12 раз), чем у Salmonella spp. Также полагают, что у N. gonorrhaeae ослаблены связи между молекулами ЛПС.

11

Вторым путем поступления антибиотиков в клетку является система, обеспечиваемая белками. Основную роль в данном случае играют белки-порины. Помимо пориновых белков в клеточной стенке обнаруживаются липопротеид Брауна, состоящий из 58 аминокислотных остатков и связанный с пептидогликаном, и белок ompA, или главный белок наружной мембраны, поддерживающий ее стабильность, выполняющий функцию рецепторов для бактериофагов, бактериоцинов и участвующий в конъюгации. Можно отметить также наличие ряда минорных белков и белков, обнаруживаемых при особых условиях культивирования.

Белки-порины образуют на наружной поверхности клетки три канала, которые в нижней части наружной мембраны сливаются в один. Каналы заполнены водой, и, следовательно, через них осуществляется транспорт гидрофильных веществ. Количество пориновых каналов может достигать 105 на клетку, молекулярный вес соответствующих белков – 30–40 тыс. Д, у E. coli их три типа – ompС, ompF, phoE. Между отдельными бактериями существуют различия в типах пориновых каналов. Например, у Salmonella имеется дополнительно ompD канал, у E.coli В – нет канала ompF. Синтез omp-белков регулируется продуктами генов ompR и envZ. Продукт гена envZ реагирует на изменение осмолярности среды и может фосфорилировать белок ompR, который в свою очередь изменяет транскрипцию генов всего оперона.

К специфическим особенностям и характеристикам пориновых белков, влияющим на поступление антибиотиков, можно отнести следующие:

1)у различных бактерий может быть различное количество типов пориновых белков и, соответсвенно, различное число каналов;

2)пориновые каналы имеют различный диаметр;

3)в зависимости от условий внешней среды (или условий культивирования) каналы определенных типов могут функционировать или нет.

Одной из существенных характеристик, влияющих на поступление веществ по каналам, является их диаметр. Формально эта величина колеблется незначительно – от 1,08 до 1,16 Å, но для поступающих веществ это имеет большое значение. Кроме размеров поступающих молекул, диаметр определяет также и создание «гидрофильных» условий: чем больше диаметр, тем дальше располагаются друг от друга выстилающие канал молекулы воды и тем легче осуществляется транспорт гидрофильных веществ. Условия культивирования могут влиять на синтез белковпоринов. Например, при высоком осмотическом давлении и повышенной

12

температуре может подавляться синтез белка ompF и, соответственно, образование наиболее широкого по диаметру канала. В средах с низким содержанием питательных веществ и осмотическим давлением синтез белка дерепрессируется.

В целом считается, что скорость диффузии через пориновые каналы зависит от гидрофобности, конформации и заряда соединения. Катионные вещества характеризуются наиболее высокой скоростью поступления, промежуточное положение занимают молекулы, не несущие заряда, медленнее всего проникают анионы. Пориновые каналы служат транспортными системами для поступления таких антибиотиков, как налидиксовая кислота, хлорамфеникол, аминогликозиды и др.

Роль различных поринов в характере поступления антибиотиков и возникающей вследствие этого устойчивости бактерий была доказана с использованием мутантных клеток. Основной вывод, который был сделан: при утрате одного или нескольких белков-поринов увеличивается МИК антибиотика(-ов) по сравнению с таковой для бактерий дикого типа. Данный факт был подтвержден и клиническими исследованиями. После нескольких дней терапии антибиотиками группы цефалоспоринов в клинических условиях был выделен мутант S. typhimurium, резистентный к ним и отличавшийся тем самым от штамма, выделенного до начала применения препарата. Оказалось, что такие мутантные клетки, в отличие от первоначально выделенного штамма, не имели одного из пориновых белков наружной мембраны.

Отмечают также и тот факт, что у некоторых микроорганизмов пориновые каналы могут находиться как в закрытом, так и в открытом состоянии. Например, для P. aeruginosa показано, что пориновые каналы имеют достаточно широкий диаметр, но большую часть времени находятся в закрытом состоянии. Данные, полученные относительно функционирования пориновых каналов, следует учитывать при создании новых антибиотиков.

Помимо каналов omp, у бактерий выявлены и специфические, предназначенные для транспорта только определенных веществ, которые тем не менее могут обеспечивать и транспорт определенных антибиотиков. К их числу можно отнести канал phoE, а также системы для транспорта витамина В12 и нуклеозидов (Tsx), мальтозы (Lam) и системы для транспорта железа (Ton). Например, через канал Tsx поступают антибиотикинуклеозиды.

Общие сведения о значении клеточных структур для поступления антибиотиков представлены в табл. 2.

13

Таблица 2

Влияние компонентов клеточных стенок бактерий на поступление антибактериальных агентов

В-третьих, при оценке спектра действия того или иного антибиотика следует учитывать наличие или отсутствие защитных механизмов в клетках микроорганизмов. В настоящее время к основным защитным механизмам относят: 1) модификацию молекул-мишеней действия антибиотика; 2) продукцию ферментов, инактивирующих антибиотик; 3) наличие систем активного выброса антибиотика из клетки.

Различают природную и приобретенную устойчивость к антибиотикам. При природной устойчивости у микроорганизмов отсутствует мишень для действия препарата. Например, микоплазмы, не имеющие клеточной стенки, устойчивы к действию β-лактамных антибиотиков. Под приобретенной устойчивостью понимают возникновение в пределах штамма клеток микроорганизмов с существенно более высокими значениями МИК антибиотика для них, чем для популяции в целом.

Клиническая устойчивость штаммов заключается в неэффективности и невозможности лечения инфекционного заболевания данным антибиотиком, хотя микроорганизм-возбудитель и обладает мишенями для его действия. В этом случае в организме не может быть достигнута такая концентрация препарата, при которой происходит подавление роста микробных клеток. Например, для некоторых энтерококков МИК цефалоспоринов, необходимая для подавления их роста за счет связывания с ПСБ, со-

14

ставляет 200 мкг/мл, однако в тканевых жидкостях организма она достигнута быть не может. С точки зрения клинической медицины к штаммам микроорганизмов, чувствительным к данному антибиотику, относят те, рост которых подавляется при терапевтической концентрации препарата в крови. Умеренно чувствительными считаются штаммы, для подавления роста которых требуются максимально переносимые концентрации препаратов. К устойчивым относят те бактерии, для которых бактериостатический эффект может быть достигнут только in vitro при высоких концентрациях препарата, являющихся токсичными для человека.

Проблема возникновения и распространения устойчивых к антибиотикам форм бактерий является фактором, ограничивающим использование ряда антибиотиков, и может быть выделена в самостоятельный раздел учения об антибиотиках. В настоящее время распространение устойчивых форм связывают со следующими факторами:

•использованием ряда антимикробных препаратов для эмпирической терапии;

•профилактическим применением антибиотиков при вирусных инфекциях;

•использованием новейших препаратов широкого спектра действия по сомнительным показаниям;

•неадекватными дозировками препаратов;

•недостаточно длительным лечением, самолечением;

•применением антибиотиков в сельском хозяйстве, особенно в качестве кормовых добавок;

•широким распространением системы «быстрого питания»;

•уменьшением грудного вскармливания.

Все перечисленные моменты необходимо учитывать при проведении рациональной химиотерапии, общий принцип которой заключается в следующем: при введении антимикробного препарата в организм в крови должна создаваться такая его концентрация, которая превосходит МИК для возбудителя заболевания, но в то же время не вызывает выраженного токсического эффекта. Исходя из этого выделяют три основных параметра антибиотикотерапии: разовая вводимая доза препарата; временной интервал между введением препарата; общая продолжительность курса, которая зависит от нозологической формы, тяжести течения заболевания и состояния больного.

Наконец, нельзя не указать на взаимодействие в инфекционном процессе между макроорганизмом и микроорганизмом. В общем виде данный процесс представлен на рис. 1.

15

Избирательность действия антибиотиков на макроорганизм следует понимать с учетом того, что про- и эукариотические клетки являются различными по строению, и это приводит к различиям в способности антибиотиков проникать в них; их действие специфично; сродство антибиотиков к структурам и веществам, имеющимся в клетках и играющим там одну и ту же роль или выполняющим сходные функции, но не идентичным, различно.

Широкое использование антибиотиков в повседневной жизни предполагает, что при их назначении следует добиваться максимального терапевтического эффекта при минимальном риске побочного действия (табл. 3). Кроме того, в современных схемах антибиотикотерапии учитываются и некоторые возможные токсические эффекты антибиотиков

(табл. 4).

3. КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИБИОТИКОВ

Классификации антибиотиков различаются в зависимости от того, какие цели преследуют при этом исследователи различных профилей. Так, например, для биолога интерес представляет классификация по штаммам-продуцентам, для врача – по спектру действия на различных возбудителей и т. д.

В зависимости от продуцирующих организмов антибиотики мо-

гут быть разделены на следующие группы:

17

1. Образуемые эубактериями:

•бактериями рода Bacillus: грамицидины, полимиксины и др.;

•бактериями рода Pseudomonas: мупироцин, пиоцианин, антифунгин и др.;

•бактериями других родов (Micrococcus, Streptococcus, Escherichia,

Proteus): низин, колиформин и др.

2.Образуемые бактериями рода Streptomyces: стрептомицин, тетрациклин, новобиоцин и др.

3.Образуемые несовершенными грибами: пенициллин, гризеофульвин и др.

4.Образуемые грибами классов базидио- и аскомицетов: термофиллин, лензитин, хетомин и др.

5.Образуемые лишайниками, водорослями, низшими растениями: усниновая кислота и др.

6.Образуемые высшими растениями: аллицин, рафанин и др.

7.Образующиеся в организмах животных: лизоцим, интерферон, круцин и др.

По механизму биологического действия антибиотики могут быть классифицированы следующим образом:

1.Нарушающие синтез клеточной стенки бактерий: бацитрацин, фосфомицин, циклосерин и др.;

2.Нарушающие функции мембран: альбомицин, грамицидин и др.;

3.Подавляющие синтез нуклеиновых кислот:

•ингибиторы синтеза пуринов и пиримидинов;

•синтеза ДНК;

•синтеза РНК.

4.Подавляющие синтез белков: хлорамфеникол, аминогликозиды, тетрациклины;

5.Ингибирующие процессы клеточного дыхания: пиоцианин, усниновая кислота, антимицины.

6.Антиметаболического действия: боррелидин, пуромицин;

7.С иммунокорректирующей активностью: циклоспорин.

По спектру действия антибиотики делятся на такие группы:

1.Противобактериальные узкого спектра действия, активные в отношении грамположительных бактерий: природные пенициллины, некоторые макролидные антибиотики.

2.Противобактериальные широкого спектра действия: тетрациклины, хлорамфеникол, аминогликозиды.

3.Противотуберкулезные: рифампицин.

4.Противогрибковые: нистатин, леворин.

18

5.Противоопухолевые: актиномицины, блеомицины.

6.Антипротозойные: фумагиллин.

При классификации антибиотиков по химической структуре учитывают, что природные и полусинтетические соединения, имеющие общую структуру, составляют один класс, название которого присваивается по первому выделенному представителю или по названию антибиотика, имеющего наиболее характерные свойства и структуру. При наименовании антибиотиков используются и другие подходы. Если структура вещества неизвестна, то название следует давать по наименованию рода или порядка, к которому относится продуцент, при этом суффикс «-мицин» присваивается только антибиотикам, продуцируемым актиномицетам. Если название было использовано ранее, то допускается применение эпитета к видовому названию продуцента. В названии антибиотика можно использовать спектр или способ его антимикробного действия. Необходимо также, чтобы название антибиотика было благозвучным.

Выделяют следующие химические группы соединений (см. приложение):

1.β-лактамные антибиотики, имеющие в структуре четырехчленное лактамное кольцо и подразделяющиеся на пенициллины и цефалоспорины.

2.Аминогликозидные антибиотики (стрептомицин, канамицин, гентамицин и др.), имеющие в структуре циклический аминоспирт, к которым через гликозидные связи присоединяются один или несколько сахаров или аминосахаров.

3.Тетрациклины, имеющие четыре конденсированных кольца.

4.Макролидные антибиотики, имеющие макроциклическое лактонное кольцо, с которым соединяются несколько аминосахаров или сахаров (эритромицин, олеандомицин). В этот класс входят также и полиеновые антибиотики (амфотерицин В, нистатин), имеющие в лактонном кольце несколько сопряженных двойных связей и разделяющиеся на диены, триены, тетраены, пентаены, гексаены и гептаены.

5.Анзамицины (рифамициновый комплекс), имеющие бициклическую структуру с длинным алифатическим мостиком и нитрифицированной боковой цепью.

6.Полипептидные антибиотики (полимиксины, низины, бацитрацины) и депсипептидные (валиномицин, энниатин В), представляющие собой циклические или линейные полипептидные цепи.

7.Антибиотики-антрациклины (дауномицин, рубомицин, карминомицин, целикамицины) – гликозиды, хромофорная группа которых представлена красноокрашенными антрациклинонами или синими пигментами актиномицетов, нерастворимыми в воде и соединенными с аминоили дезоксисахарами, иногда с аминокислотами.

19