3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

Фузидиевая кислота

Рис. 6. Ингибирующее действие фузидиевой кислоты на процесс биосинтеза белка

Устойчивость к фузидиевой кислоте обусловлена изменением фактора элонгации за счет хромосомальных мутаций, что приводит к изменению белоксинтезирующей системы. Такие мутанты характеризуются низкими скоростями роста. Другой механизм опосредован наличием плазмидных генов и связан с удалением антибиотика из клетки. Наконец, существует механизм устойчивости за счет хлорамфениколацетилтрансферазы I типа энтеробактерий, которая связывает молекулу антибиотика и препятствует связыванию с фактором G.

9.АНТИБИОТИКИ — ИНГИБИТОРЫ РЕПЛИКАЦИИ

ИТРАНСКРИПЦИИ ДНК И РНК

Антибиотики, относящиеся к данной группе, могут быть разделены следующим образом:

1)ингибиторы синтеза предшественников нуклеиновых кислот;

2)ингибиторы реакций полимеризации, среди которых:

•ингибиторы матричных функций ДНК;

•ингибиторы ферментов (ДНК-полимераз, РНК-полимераз и др.).

70

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Антибиотики, относящиеся к первой группе, как правило, рассматриваются как потенциальные соединения при терапии опухолей и вирусных инфекций. Однако их не следует считать соединениями с избирательным действием, так как нуклеотиды участвуют во множестве клеточных процессов и их эффект достигается за счет совокупного действия на клетку.

Для большинства антибиотиков данной группы механизм действия заключается в ингибировании ферментов на отдельных этапах пути синтеза нуклеотидов. Так, например, азасерин имеет большое сходство с глутамином, и при образовании связи с одним из ферментов пути биосинтеза пуринов ковалентная связь между SH-группой цистеина в молекуле фермента и азасерином более прочна, чем между глутамином и ферментом. По такому же механизму действует и диазооксонорлейцин. Ингибиторы конкретных реакций не имеют высокой специфичности и по этой причине ингибируют ряд реакций, в которых принимает участие глутамин. Аналогом аспарагиновой кислоты является хадацидин (Penicillium), который действует на стадии амидирования УМФ, причем его участие в реакции является достаточно специфичным.

К веществам – ингибиторам синтеза пуринов относятся синтетические соединения из группы сульфаниламидов, триметоприм, метотрексат. Их действие основано на подавлении синтеза фолиевой кислоты на разных стадиях. Мишенью для действия сульфаниламидов является фермент дигидроптероатсинтаза (ДГПС); для триметоприма – дигидрофолатредуктаза (ДГФР), которая восстанавливает фолиевую кислоту в ди- и тетрагидрофолиевую. Последняя является донором одноуглеродных единиц на стадии синтеза пуринов и пиримидинов. Сульфаниламиды по структуре близки к парааминобензойной кислоте, и возможный механизм их действия заключается в подавлении включения ПАБК в фолиевую кислоту либо включение вместо ПАБК. Добавление фолиевой кислоты экзогенно не снижает ингибирующий эффект, поскольку она не в состоянии проникать в клетки бактерий. На клетки животных сульфаниламиды не действуют, так как они не синтезируют фолиевую кислоту (рис. 7).

Резистентность определяется наличием ДГПС, устойчивых к сульфаниламидам. Кроме хромосомально локализованных генов их синтеза, имеются также и гены, локализованные на плазмидах и детерминирующие ДГПС I и ДГПС II. Ферменты характеризуются различной стабильностью при разных температурах, молекулярной массе и обладают

71

при этом слабым сродством к сульфаниламидам, но не к ПАБК. Показано, что ферменты I типа обнаруживаются чаще всего у плазмидсодержащих штаммов энтеробактерий с множественной лекарственной резистентностью. Такие плазмиды являются конъюгативными. Ферменты II типа cинтезируются клетками с неконъюгативными плазмидами IncQ групп несовместимости, имеющими дополнительно устойчивость к стрептомицину, обусловленную наличием фосфоаденилилтрансфераз. Считают, что оба типа ферментов синтезируются конститутивно, хотя их синтез и находится под контролем разных промоторов. Менее распространенной является устойчивость, связанная со снижением поступления антибиотика в клетку.

птеридин + парааминобензойная кислота

дигидроптероатсинтаза сульфаниламид

дигидроптероевая кислота + глутаминовая кислота

дигидрофолат

дигидрофолатредуктаза триметоприм

тетрагидрофолат

Рис. 7. Мишени для действия сульфаниламидных препаратов в клетке

72

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Устойчивость к триметоприму, детерминируемая плазмидными генами, связана с образованием четырех типов ДГФР. Ферменты I и II типа определяют высокий уровень резистентности (200–1000 мкг/мл), а их синтез детерминируют гены, находящиеся в составе Tn7 и Tn702. Ферменты III и IV типа определяют средний (100 мкг/мл) и низкий (8 мкг/мл) уровень резистентности соответственно. Ферменты отличаются друг от друга и от хромосомально локализованных генов по молекулярной массе, оптимуму рН, стабильности, чувствительности к ингибиторам и т. д. Устойчивость, определяемая хромосомальными генами, связана с повышенной продукцией фермента (в 80–100 раз).

Обычно в клинике оба препарата используются в комплексе (бисептол, сульфатон) для лечения урогенитальных инфекций и инфекций пищеварительного тракта (этазол, фталазол). Следует отметить, что используемые по отдельности препараты обладают бактериостатическим, а совместно – бактерицидным действием. Возможным побочным действием является кристаллурия: образование в печени нерастворимого ацетата сульфаниламида; изменение формулы крови, повышенная чувствительность к препаратам.

К числу ингибиторов матричных функций ДНК относятся соедине-

ния, которые могут препятствовать за счет встраивания в нее процессу транскрипции или же способны вызывать изменения структуры за счет разрывов, модификации или выщепления цепей ДНК.

Модификацию цепей за счет встраивания осуществляют некоторые интеркалирующие соединения, гистологические красители (акридины, бромистый этидий). Красители легко связываются с ДНК in vitro, вызывая при этом изменение флуоресценции. Существуют данные, которые позволяют утверждать, что профлавин может связываться с ДНК сильно (первичное связывание) или более слабо (вторичное). Специфичности связывания красителей с определенными парами оснований не обнаружено. Показано, что плоская ароматическая молекула профлавина интеркалирует между парами оснований. Пары оснований при этом остаются перпендикулярными оси спирали, но раздвигаются на 3,4 Å (толщина профлавина). Известно также, что одно связывание приходится на 2–2,5 пары оснований. На первой стадии происходит быстрое, зависящее от концентрации связывание с ДНК за счет электростатических сил. В результате следующих стадий наблюдается интеркаляция, вероятно, за счет изгибания молекулы ДНК.

Связывание с ДНК придает молекуле некоторые измененные свойства: увеличивается вязкость растворов ДНК, снижается коэффициент седиментации, а термостабильность молекулы повышается. Степень из-

73

менений пропорциональна количеству вещества. ДНК с интеркалированными красителями имеет более жесткую структуру, следовательно, увеличивается вязкость растворов. Снижение седиментации и плавучей плотности связано с уменьшением массы на единицу длины, так как интеркалирующий агент имеет те же размеры, что и нуклеотид, но в два раза меньшую массу. Более высокая термостабильность объясняется тем, что для удаления агента из спирали требуются дополнительные затраты энергии. При взаимодействии с ДНК интеркалирующие соединения предпочитают суперскрученную структуру.

По механизму интеркалирующего взаимодейсвтия с ДНК работают

имногие противоопухолевые антибиотики. Такие антибиотики получили название межкаланты. Следует отметить, что чрезвычайно сложно в данном случае выделить только одно воздействие противоопухолевых антибиотиков: как правило, эффект бывает многофункциональным, затрагивающим различные уровни метаболизма клетки. В различных странах к применению разрешены блеомицин, рубомицин (дауномицин), митомицин С, актиномицин D (дактиномицин).

Наличие противоопухолевой активности у актиномицинов, выделенных в 1940 году, было продемонстрировано только в 1952 году. Антибиотики продуцируются Streptomyces antibioticus семействами. В настоящее время выделено около 100 различных актиномицинов, продуцируемых примерно 50 видами актиномицетов. В лечебной практике используются два препарата с очень высокой токсичностью – актиномицин Д и С. Молекула антибиотика состоит из хромофорной части (актиноцина) и чаще всего депсипептидной части, представленной двумя лактонными пентапептидами. В образовании лактонной части участвует треонин, а ее разрыв принципиален для активности антибиотика. Синтез антибиотика происходит в два этапа: синтез хромофорной части и синтез нерибосомным путем пептидного фрагмента.

Особенностью биологического действия актиномицина Д является то, что он действует на микробные клетки, ингибирует рост нормальных

ималигнизированных клеток животных, подавляет рост опухолей. Однако в качестве антибактериального препарата не используется, так как обладает малой токсичностью, а в клетки грамотрицательных бактерий проникает плохо.

Установлено, что антибиотик ингибирует ДНК-зависимый биосин-

тез РНК за счет образования комплекса с ДНК-матрицей без взаимодействия с РНК-полимеразой. Актиномицин ингибирует стадию элонгации цепи РНК, его функция состоит в том, что он препятствует продвижению РНК-полимеразы вдоль ДНК. Для выполнения данной функции необхо-

74

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

димо образование прочного, медленно диссоциирующего комплекса. Для этого ДНК должна находиться в двуспиральном состоянии в β-кон- фигурации, в ее составе должны быть остатки гуанина с NH2-группами, расположенными в малой бороздке. При различном содержании ГЦ-пар число мест связывания актиномицина Д составляет 5–6 на 100 п.о. ГЦ, т. е. не все остатки гуанина участвуют в реакции.

В различное время появилось несколько моделей для объяснения связывания актиномицина Д с ДНК, и их разделили на два типа: модели поверхностного связывания и интеркаляционные. Предполагается, что молекула актиномицина Д частично погружается в малую бороздку двойной спирали и удерживается там за счет водородных связей между функциональными группами антибиотика и ДНК. Вторая модель предполагает, что актиномицин Д внедряется между парой ГЦ и соседней за счет хромофорной части молекулы.

Эксперименты на клетках животных показали, что актиномицин Д способен превращаться ферментами микросомальной фракции печени в свободный радикал. Такой радикал является фармакологически активным, и существуют два пути его действия на клетку: конформационные изменения гидрофобной области мембран, что нарушает их транспортную функцию и вызывает гибель клетки, и образование активных форм кислорода, что вызывает перикисное окисление липидов, повреждения и разрыв ДНК.

Группа антрациклиновых антибиотиков содержит в своей структуре антратетрациклиновый хромофор, связанный с одним или несколькими остатками сахаров. Антибиотик рубомицин (S. rubomycini) выделен в 1971 году, в качестве сахарного остатка содержит необычный сахар даунозамин. Антибиотик активен в отношении грамположительных бактерий, грибов, простейших, обладает сильно выраженной антимитотической активностью, вызывает хромосомные аберрации и разрывы в ДНК.

Активность данных антибиотиков, вероятно, связана с нарушением матричной активности ДНК в процессе репликации или транскрипции в результате образования стабильных комплексов антибиотика с ДНК. Считают, что в основе действия на ДНК лежит образование интеркаляционных комплексов. Молекула антибиотика встраивается в цепь ДНК без выраженной специфичности, хромофор интеркалирует между парами основаниий, а сахар располагается в малой бороздке. Вклад в противоопухолевую активность вносит и образование одно- и двухнитевых разрывов, возможной причиной чего является образование свободных радикалов при активации антибиотика микросомальной фракцией.

75

Блеомицины (S. verticillus) выделены в 1966 году и синтезируются в виде комплексов, состоящих из 2–5 различных молекул. Антибиотик очень активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способен вызывать образование нитевидных форм, индуцировать синтез колицинов и исключение профага, обладает противоопухолевой активностью. Считают, что в образовании комплексов с ДНК важную роль играет процесс интеркаляции. Действительно, обнаружено раскручивание витков спирали на 3,1 А при связывании с молекулой антибиотика, интеркаляция и фрагментация ДНК происходят чаще в последовательности ГЦ или ГТ. Косвенным доказательством интеркаляции является образование мутаций со сдвигом рамки.

Блеомицин связывается с ДНК за счет механизмов, не требующих наличия ионов металлов. Однако для фрагментации ДНК определенные ионы металлов, например железа, все же необходимы. Деградацию определяет тройной комплекс: блеомицин – ДНК – железо (II). Окисление этого комплекса приводит к генерированию гидроксильных радикалов в непосредственной близости к ДНК, что и определяет процесс. Особое значение имеет наличие кислорода. Эксперименты показали, что разрыв связи происходит между С3 м С4 атомами углерода в дезоксирибозе.

Митомицин С относится к группе хиноксалиновых антибиотиков. Выделен в 1956–1958 годах из культуральной жидкости S. caespitosus. Антибиотик проявляет активность в отношении бактерий, простейших, водорослей, опухолевых клеток. Как в бактериальных клетках, так и в клетках животных антибиотик избирательно подавляет синтез ДНК. В. Шибальски показал, что митомицин С вызывает образование поперечных сшивок в ДНК после внутриклеточной активации антибиотика. Считают, что в клетке происходит восстановление митомицина до гидрохинонов, а образующееся реакционноспособное соединение по двум центрам может атаковать гуанин, после чего и образуются сшивки. Причем они являются высокостабильными, т. е. антибиотик – бифункциональный алкилирующий агент. Образование сшивок приводит к нарушению разделения нитей ДНК при репликации. Частота образования сшивок возрастает с увеличением содержания ГЦ-пар. В синтетических нуклеотидах алкилирование гуанина происходит в четыре раза чаще, чем других нуклеотидов. Алкилированная митомицином С ДНК обладает пониженной матричной активностью в РНКили ДНК-полимеразных реакциях, значительно медленнее расщепляется различными экзонуклеазами.

К соединениям – ингибиторам активности ферментов, участвующим в репликации и транскрипции ДНК, относятся высокоактивные бак-

терицидные синтетические химиотерапевтические средства широкого

76

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

спектра действия, получившие название хинолонов и фторхинолонов. Препараты группы хинолонов (налидиксовая кислота) предложены к использованию в 1962 году, фторхинолоны – в 1978–1980 годах. В соответствии с активностью среди препаратов данной группы нефторированные соединения относят к I и II поколениям, фторированные производные делят на препараты III и IV поколений.

Сравнивая общую структуру хинолонов и фторхинолонов, можно отметить, что принципиальными изменениями, влияющими на антибактериальную активность, являются наличие атома фтора в положении 6 (в цикле В) и наличие в цикле А шестичленного цикла с кето- и карбоксильной группой по отношению к азоту. Далее принципиальным является также наличие в цикле В заместителей по 7 положению (пиперазиновый цикл). В настоящее время получены ди- и трифторированные хинолоны, однако улучшение их свойств требует и специфических заместителей по другим положениям. На данный момент в практике используется 15 препаратов. Их особенности представлены в табл. 11.

Поступление в клетку препаратов группы хинолонов определяется их гидрофобностью, а также способностью взаимодействовать с катионами наружной мембраны. Считается, что нефторированные соединения, которые являются гидрофобными, поступают непосредственно через слой фосфолипидов и липополисахаридов, а фторированные – через пориновые каналы, например ompF. Взаимодействие с катионами магния нарушает целостность мембраны, и, следовательно, используется механизм «самопромотирования». Через цитоплазматическую мембрану антибиотик поступает путем диффузии через фосфолипидные слои, создается градиент концентрации между ее наружной и внутренней поверхностью. Поступление антибиотиков не требует затрат энергии.

Механизм действия антибиотиков был расшифрован в середине 1970-х годов, и долгое время считалось, что основной мишенью является ДНК-топоизомераза II, которая присутствует и у про- (ДНК-гираза II), и у эукариот, но имеет различную структуру. Фермент является тетрамерным белком и состоит из двух субъединиц А и В, которые катализируют строго определенные этапы в процессе формирования необходимой укладки ДНК в хромосоме:

1)разрыв спирали ДНК и образование комплекса ДНК + субъединица А;

2)отрицательная спирализация, энергозависимый процесс, гидролиз АТФ в присутствии Mg2+ – субъединица В;

3)восстановление двойной спирали, формирование окончательной укладки ДНК – субъединица А.

77

Таблица 11

Некоторые особенности клинического использования соединений группы хинолонов и фторхинолонов

Считают, что в субъединице А имеются различные функциональные домены. В N-участке остаток tyr122 способен за счет гидроксильной группы взаимодействовать с одним 5′-фосфатом углеводно-фосфатного остова ДНК, именно это и обеспечивает разрыв-воссоединение молекулы ДНК. На каталитическую функцию тирозина влияют и прилегающие остатки аминокислот от 67 до 106, особенно серин в 83 и аспарагин – в 87 положениях. Данные аминокислоты образуют так называемый «хинолоновый карман».

Существует несколько моделей молекулярных механизмов действия антибиотиков, принципиально не отличающихся между собой. Прежде всего, отмечают, что сходства между ДНК, АТФ и фторхинолонами не существует, следовательно, не может быть конкурентного ингибирования. Скорее всего, молекулы хинолонов связываются непосредственно с однонитевой ДНК, образуемой гиразой, и реагируют с азотистыми основаниями за счет образования водородных связей своих 3-карбокси- и 4-ок- согрупп. Возможно, что хинолоны стабилизируют связывание ДНК и гиразы, обусловливая конформационные изменения комплекса или препятствуя внутренней подвижности субъединиц гиразы. Это происходит перед разрывом ДНК, в результате прекращается не только репликация, но и транскрипция. В последнее время учитывают, что фторхинолоны могут влиять и на ДНК-топоизомеразу IV, обеспечивающую расщепление цепей

78

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

после завершения репликации. ДНК-топоизомераза IV состоит из четырех полипептидных цепей, обозначаемых С2F2. При этом у грамотрицательных бактерий более чувствительной является топоизомераза II, а у грамположительных – топоизомераза IV. Гены, кодирующие синтез топоизомераз, обозначаются Gyr A, Gyr B и Par A, Par B соответственно.

После поступления в клетку и взаимодействия с ДНК-гиразой происходит следующее:

•нарушение биосинтеза белка, индукция белков SOS-ответа (нарушение деления клеток, образование филаментов);

•при высоких концентрациях антибиотика наступает необратимое нарушение деления, глубокие структурные изменения в ядре и цитоплазме клеток и их гибель.

Отмечая бактерицидный эффект действия, указывают, что хинолоны

ифторхинолоны в высоких концентрациях ингибируют биосинтез белка

иРНК. В качестве последствий действия антибиотиков всех типов отмечают механизм А in vitro (парадоксальный эффект): снижение бактерицидной активности, так как при таких концентрациях подавляется синтез белка и РНК. Такой эффект может быть и при совместном действии с ингибиторами синтеза белка (тетрациклином, хлорамфениколом). Другой механизм действия В – сохранение бактерицидной активности в условиях подавления синтеза белка и РНК. Он показан для некоторых препаратов и, наряду с механизмом А, проявляется или отсутствует в зависимости от вида или штамма бактерий. Наконец, некоторые препараты могут проявлять свое действие в отношении неделящихся клеток, находящихся

вбуфере (механизм С) (рис. 8).

Вмеханизме действия следует учитывать и эффект на клетку суббактериостатических концентраций антибиотиков: снижаются адгезивные свойства бактерий, подавляется индукция экзо- и эндотоксинов и ферментов, снижаются вирулентные свойства, повышается чувствительность клеток к фагоцитозу. Лечебные свойства фторхинолонов повышаются в присутствии аминогликозидных антибиотиков, что объясняется общими путями поступления, нарушением ori репликации; антагонистическими являются препараты – ингибиторы биосинтеза белка и РНК; ин-

дифферентными – β-лактамные антибиотики.

В настоящее время описаны три механизма устойчивости к фторхинолонам, хотя и отмечают, что спонтанные мутации возникают с низкой частотой – 10–9–10–11. Наиболее важным считают тип мутаций, приводящий к изменению ДНК-гиразы. Эти мутации являются хромосомальными и определяют устойчивость ко всем хинолонам и фторхинолонам. Наиболее высокий уровень резистентности обеспечивается мутациями в субъединице А, в этом случае фиксируют изменения в соответствующих участках белка, так называемых «хинолоновых карманах».

79