3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

3. Антисептики, действующие по мембранатакующему механизму,

могут вызывать разрушение входящих в состав мембраны полимеров, что приводит к лизису микробных клеток, или нарушает функции мембран (осмотическую проницаемость, перенос ионов через мембраны). Основная масса соединений такого рода – поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые могут быть разделены на три группы: катионные (четвертичные соединения аммония), анионные (щелочные мыла, желчные кислоты) и нейтральные.

Антимикробное действие ПАВ зависит от типа соединения. Наибольшим бактерицидным эффектом обладают катионные ПАВ, промежуточным – анионные, слабым – нейтральные. Катионные ПАВ – уникальный класс дезинфицирующих веществ, в силу того что растворимы в воде, не имеют запаха, активны в высоком разбавлении в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, спор, нитчатых водорослей и других объектов.

Амфифильная природа ПАВ позволяет им гидрофильной частью молекулы взаимодействовать с белками, нарушая их конформацию, а липофильной – с липидами. Разрушение бактериальных клеток под влиянием ПАВ происходит после адсорбции и проникновения их в клеточную мембрану, где они изменяют ее молекулярную организацию. Это сопровождается изменением проницаемости и осмотического равновесия, после чего наблюдается выход в среду внутриклеточного содержимого: катионов К+, аминокислот, веществ с максимумом поглощения в области 260 нм.

Механизм устойчивости к ПАВ можно рассматривать с точки зрения химической организации клеточных мембран микроорганизмов. Известно, что чем больше липидов содержится в клеточной стенке, тем выше их устойчивость к ПАВ. Для проявления устойчивости имеет значение, кроме общего количества липидов, их состав и расположение в мембране. Повышенную устойчивость к ПАВ туберкулезных бактерий связывают с наличием в составе их липидов особого гликолипида – корд-фактора.

Одним из лучших катионных антисептиков является хлоргексидин. Это вещество активно в отношении широкого круга микроорганизмов в относительно низких концентрациях (10–50 мкг/мл), имеет низкую токсичность и проявляет слабое раздражающее действие на слизистую оболочку полости рта. При использовании в качестве полоскания действует на Streptococcus mutans, снижая вероятность кариеса; обладает способностью накапливаться в тканях, что говорит о пролонгированном действии. Может влиять как на цитоплазматическую, так и наружную мембрану бактерий.

30

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

6. АНТИБИОТИКИ – ИНГИБИТОРЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ

Соединения, относящиеся к этой группе, являются практически антисептическими веществами. Среди них обнаружены те, которые могут действовать на клетки бактерий и высших организмов. Это обусловлено различиями в мембранах – присутствием различных стеринов: зимостеринов и эргостеринов у растений и грибов, холестерина у животных.

Все антибиотики, действующие на клеточную мембрану, могут вызывать нарушение осмотических свойств клетки, не являясь при этом высокоспецифичными. Зачастую они относятся к токсичным соединениям и в силу этого применяются местно. Антибиотики этой группы могут быть классифицированы следующим образом:

1)вещества, нарушающие надмолекулярную структуру и организацию клеточной мембраны, что приводит к высвобождению клеточных веществ;

2)вещества-ионофоры, участвующие в транспорте катионов и ионов. Они могут быть подразделены:

а) на каналообразователи (образуют в мембране канал для определенных веществ);

б) подвижные переносчики, проходящие с ионом через мембрану, или подвижные ионофоры.

К веществам первой группы, нарушающим структуру мембраны, относят соединения двух типов в химическом отношении. Это антибиотики, которые имеют пептидное кольцо, состоящее менее чем из 10 аминокислот, но к этому кольцу присоединяется пептидная цепь, а к ней – разветвленная жирная кислота (8–9 атомов углерода). Их примером являются полимиксины. Активны данные соединения в отношении грамотрицательных бактерий. Вещества второй группы (грамицидин С и тироцидины) являются циклическими полипептидами, состоящими из 10 аминокислот и имеющими свободные аминогруппы, активны в отношении грамположительных бактерий.

Полимиксин В – бактерицидный антибиотик, продуцируемый бактериями Bacillus polymixa. Положительно заряженный полипептид элек-

тростатически связывается с анионными фосфатными группировками мембранных фосфолипидов, вытесняя при этом катионы Mg2+, обеспечивающие стабильность мембраны. Одновременно во внутренние гидрофобные участки мембраны встраивается боковая цепь жирной кислоты. Структура мембраны изменяется, и нарушаются параметры ее прони-

31

цаемости (происходит потеря ионов К+). Нарушения структуры наружной мембраны при электронно-микроскопическом анализе выглядят как выпячивания (в виде пузырей) из-за увеличения площади ее поверхности. Существует несколько аналогий между действием полимиксинов и таких антисептиков, как хлоргексидин. Одна из них заключается в том, что токсический эффект может быть снижен при повышении концентрации двухвалентных катионов.

Полимиксины избирательно действуют на грамотрицательные бактерии и очень слабо на грамположительные. К ограничениям при использовании полимиксинов следует отнести возможный нефротоксический эффект.

Группу ионофорных антибиотиков составляют несколько различных в химическом отношении соединений, общим для них является то, что они способны облегчать перенос через мембраны различных неорганических катионов. Эти соединения не нашли широкого применения в лечебной практике в силу неспецифического действия и токсичности, однако они используются в научных исследованиях как инструмент для определения функций мембран.

Типичный представитель таких антибиотиков – валиномицин. Это депсипептидное циклическое соединение. Из 12 компонентов кольца аминокислоты располагаются таким образом, что попарно чередуются D- и L-формы, а также амино- и оксикислоты. Если аминокислот шесть (энниатин), то каждый компонент кольца имеет другую конфигурацию. С катионами калия, для которых валиномицин является высокоспецифическим переносчиком, образуется комплекс, в котором (как показал рентгеноструктурный анализ), калий соединяется с внутренней частью молекулы шестью кислородными связями. Кольцо имеет такие размеры, которые позволяют идеально разместиться в нем только ионам калия, причем без гидратной оболочки. Общий заряд всего комплекса положительный. Валиномицин способен образовывать комплексы и с катионами натрия, но их размеры меньше, и константа сродства примерно в тысячу раз ниже.

Действие валиномицина на мембрану обусловлено высокой специфичностью комплекса и его гидрофобностью снаружи. Липофильная молекула калий – валиномицин с общим положительным зарядом перемещается через мембрану путем простой диффузии, удаляя катионы калия из клетки. Процесс очень эффективен: одна молекула может переносить до 104 ионов в минуту. Выкачивание катионов калия в конечном итоге приводит к ингибированию процессов биосинтеза белка.

32

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

По сходному механизму работает и антибиотик нонактин, относящийся к группе макротетралидов. За счет наличия циклической структуры он также позволяет заключить катион калия (или другие однозарядные катионы – NH4, Na+) в оболочку из восьми атомов кислорода. Наружная поверхность является липофильной.

Антибиотикам с линейной структурой – монензину и нигерицину – также присуща способность транспортировать катионы калия и натрия соответственно. В данном случае конформация линейной молекулы изменяется таким образом, что она как бы складывается, и карбоксильная группа на одном конце способна образовывать связь с гидроксильной группой на другом. Внутри такой структуры находятся катионы за счет формирования связей с кислородом. Монензин имеет важное практическое значение, так как является средством, предотвращающим развитие кокцидиоза у кур. При этом использование его не ограничивается – устойчивые формы появляются относительно редко, а пищеварение улучшается.

К антибиотикам-ионофорам, образующим в мембране поры, относится грамицидин А. Это линейная молекула, в которой наблюдается чередование D- и L-форм аминокислот. С одним концом полипептида связан этаноламин, с другим – формильная группа. По характеру переносимого иона это родственное валиномицину соединение, однако механизм процесса совершенно иной. При выяснении его действия учитывали тот факт, что в системе in vitro липидная мембрана, разделяющая растворы с различной концентрацией калия, при определенной температуре переходит в твердое состояние. В таких условиях перенос катионов калия с участием валиномицина (также специфического переносчика для них) резко снижается или не наблюдается вообще.

В случае же использования грамицидина А проведение калия происходит, скорее всего, за счет образования пор. Спиральная структура молекулы изменяется таким образом, что внутренняя поверхность становится гидрофильной, а наружная – липофильной. Одна молекула антибиотика не имеет достаточной длины, чтобы образовывать пору через весь липидный слой, и считают, что две молекулы соединяются «голова к голове». Размеры канала таковы, что по нему могут перемещаться небольшие одновалентные катионы. При этом участок канала, где в данный момент находится ион, становится шире и короче. Время жизни такой поры мало (около одной секунды), однако она весьма активна в отношении транспорта: через отверстие может переноситься до 107 катионов калия.

Антибиотики-полиены относятся к группе макролидных и имеют большое лактонное кольцо. Гидрофобная часть молекулы содержит систему сопряженных двойных связей (4–7). Противоположный участок является гидрофильным за счет наличия ОН-группировок. В медицине ис-

33

пользуются нистатин, амфотерицин В, относящиеся к противогрибковым препаратам. Особенностью полиеновых антибиотиков является то, что они действуют только на мембраны со стеролами. Однако в некоторых случаях они могут взаимодействовать и с холестерином, вызывая побочное действие на макроорганизм (гемолиз, нефрит).

Обобщенная модель образования поры (для амфотерицина В) в мембране и нарушение функций последней выглядит следующим образом. Молекула антибиотика своим полярным концом, представленным аминосахаром и карбоксильной группой, заякоривается на поверхности мембраны. Участок молекулы с ОН-группами взаимодействует с таким же участком другой молекулы, а липофильный участок с двойными связями реагирует с углеводородной частью мембранных липидов. Десять молекул амфотерицина образуют замкнутый канал со скрытыми полигидроксильными группами и с выступающими липофильными. Между двумя молекулами антибиотика располагается молекула стерола. Из этого следует объяснение повышенной чувствительности мембран, содержащих стеролы, к полиенам: наблюдается повышенная ригидность углеводородных цепей фосфолипидов в мембране, что усиливает взаимодействие между антибиотиками и стеролами. Как уже отмечалось, заякоренная часть молекулы остается на поверхности мембрана – водная среда. Липофильный остов молекулы располагается вдоль цепей жирных кислот. В одном липидном слое образуется полупора, в двойном бислое – полная. Две полупоры образуют полную за счет водородных связей.

Диаметр образованной поры соответствует по размерам молекулам глюкозы, следовательно, через нее могут удаляться вещества и меньшего размера: ионы калия, аммония, нуклеозиды, некоторые аминокислоты. Потеря жизнеспособности происходит не только за счет потери тех или иных компонентов цитоплазмы, но и за счет снижения рН и коагуляции белков при поступлении водородных ионов. Известно, что пора может находиться в трех состояниях: открытом, т. е. проводящем, короткоживущем закрытом и непроводящем (неактивном). В активном проводящем состоянии каналы могут находиться 220–260 с, а за 1 с переносить

2,5–10 · 106 ионов.

Антибиотик филипин, молекула которого не имеет полярной части, взаимодействует с мембранами за счет образования стопок, представленных параллельными рядами молекул. В конечном итоге образуется крупный агрегат диаметром 150–200 Å, расположенный внутри мембраны. Два таких агрегата образуют сверхагрегат, в котором гидрофильные стороны повернуты друг к другу. Образование таких крупных включений в мембране ведет к ее разрушению.

34

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

К числу антибиотиков, нарушающих поступление катионов в клетку, относят и сидеромицины, механизм действия которых связан с особенностями поступления железа в клетки бактерий. Рассматривая действие антибиотика, следует учесть, что поступление железа в клетки при его дефиците в окружающей среде связано с несколькими стадиями:

•клетка синтезирует кофактор (сидерофор) транспорта железа;

•кофактор освобождается из клетки во внеклеточную среду орга- низма-хозяина;

•часть железа связывается с сидерофором, экстрагируя его из тканевых жидкостей;

•комплекс поступает в клетку микроорганизмов с помощью специфических переносчиков, локализованных в их мембране;

•по мере необходимости железо высвобождается из хелатного комплекса либо за счет восстановления, либо за счет ферментативного гидролиза лиганда.

Считают, что сидеромицины конкурируют с сидерофорами и, следовательно, подавляют поступление железа в клетку. Примером сидеромициновых антибиотиков является альбомицин. У E. coli белки (феррихромы), которые участвуют в накоплении железа, структурно сходны с альбомицином и транспортируются в комплексе с железом через наружную мембрану с участием как минимум двух белков – TonA

иTonB. В присутствии альбомицина нарушается взаимодействие белка TonA и феррихрома (рис. 3), вследствие чего прекращается транспорт железа в клетку и нарушается ее рост.

35

7. АНТИБИОТИКИ, ИНГИБИРУЮЩИЕ ПРОЦЕССЫ ОБРАЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ БАКТЕРИЙ

В данную группу могут быть объединены соединения, препятствующие биосинтезу клеточной стенки на различных этапах. В общем виде можно выделить три группы таких соединений:

1)ингибиторы образования компонентов, из которых строится клеточная стенка;

2)ингибиторы реакций переноса структурных блоков клеточной стенки из цитоплазмы наружу;

3)ингибиторы образования связей (сшивок) между элементами пептидогликана.

Общими свойствами антибиотиков, относящихся к данным группам, можно считать бактерицидный эффект при их действии; эффективное воздействие только на делящиеся клетки, а также устойчивость к ним бактерий без клеточной стенки (табл. 6).

Прежде чем рассматривать механизм их действия, следует остановиться на некоторых особенностях структуры и биосинтеза пептидогликана. Пептидогликан имеется в клеточных стенках грамположительных (20–30 слоев), грамотрицательных (2–4 слоя) бактерий, архебактерий (псевдомуреин) и отсутствует у микоплазм. Полисахаридная часть пептидогликана представлена N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой (N-ацетилглюкозамин после присоединения молочной кислоты) кислотой. Исходным веществом для синтеза обоих является глюкоза. К карбоксильной группе мурамовой кислоты присоединяются пептидные фрагменты, представленные как D-, так и L-формами аминокислот, в которых также имеются диаминокислоты. Синтез пептидогликана делят на три этапа:

1)сборка и синтез структурных единиц (N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенной с пентапептидом) вцитоплазме;

2)перенос их с помощью специфического переносчика (бактопре-

нол, или ундекапренилпирофосфат, фосфорилированный С55 спирт), локализованного в мембране, на ее наружную поверхность;

3)образование связей (гликозидных и пептидных) на наружной стороне мембраны. В процессе участвуют трансгликозидазы, транспептидазы и карбоксипептидазы. Между четвертым остатком D-ала- нина в одной пентапептидной цепочке и одной из диаминокислот в соседней образуется пептидная связь, после чего удаляется пятый остаток D-аланина.

36

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Таблица 6

Влияние некоторых антибиотиков на отдельные этапы биосинтеза клеточной стенки

К антибиотикам, ингибирующим образование предшественников, относят фосфомицин и D-циклосерин. Первое соединение было обнаружено в начале 1970-х годов, продуцентом его являются стрептомицеты

(Streptomyces fradiae, Streptomyces viridochromogenes). Антибиотик взаи-

модействует с ферментом, участвующим в образовании N-ацетилму- рамовой кислоты, связанной с уридиндифосфатом, действуя как аналог ФЕП (фосфоенолпирувата) и связывается с цистеином в активном центре трансферазы. Мишень для действия антибиотика находится в цитоплазме, и реакция является весьма специфичной: на другие ферменты и реакции с участием ФЕП антибиотик не действует.

Поступление антибиотика происходит за счет двух транспортных систем – для гексозофосфатов и для глицерофосфата. За счет увеличения поступления в присутствии этих соединений активность антибиотика возрастает. В настоящее время обнаружены несколько механизмов резистентности к фосфомицину: изменение систем транспорта или ослабление сродства между ферментом-мишенью и антибиотиком за счет хромосомальных мутаций. При устойчивости, детерминируемой плазмидными генами и обнаруженной у кишечных бактерий Serratia marcescens,

37

выявлен транспозон Tn2921, кодирующий синтез локализованного в цитоплазме белка Fos (16 Кд). С антибиотиком связывается глутатион (два глутамата, соединенных через цистеин), а глутатионтрансфераза катализирует раскрытие цикла молекулы. Наконец, возможна одновременная устойчивость, определяемая как плазмидными, так и хромосомальными генами и имеющая различные механизмы.

Действие фосфомицина с другими антибиотиками может быть как синергидным, так и антагонистическим. Возможно, что в его присутствии уменьшается или увеличивается количество пенициллинсвязывающих белков в клеточной стенке или же продукты повреждения пептидогликана включаются как эффекторы в систему регуляции синтеза β-лак- тамаз. Антибиотик является бактерицидным, его использование в клинике ограничено.

D-циклосерин (Streptomyces lavendulae) следует рассматривать как антагониста D-аланина, что обусловлено их структурным сходством. При действии антибиотика в цитоплазме клеток накапливается трипептидное производное N-ацетилмурамовой кислоты, лишенное двух концевых D-аланиновых остатков. Мишенью для действия фермента являются рацемаза L-аланина и синтетаза D-аланина. Было продемонстрировано, что циклосерин структурно сходен с одной из возможных конформаций D-аланина, а его сродство к синтетазе намного больше, чем для природного субстрата. Устойчивость к антибиотику может быть связана с повышением уровня синтеза ферментов, взаимодействующих с антибиотиком, либо с утратой способности к его транспорту в клетку (через систему аланина).

Бацитрацин А относится к антибиотикам, связывающимся с моле- кулами-переносчиками. Этот пептидный антибиотик, продуцируемый Bacillus lichiniformis, выделенный в 1945 году, обладает повышенной токсичностью для организма за счет возможного связывания со стеролами мембран и используется местно для подавления грамположительной микрофлоры.

Антибиотик подавляет перенос через мембрану мурамилпентапептида к растущей цепи пептидогликана. В процессе переноса происходит фосфо- рилирование-дефосфорилирование бактопренола, который только в дефосфорилированной форме способен связывать и при последующем фосфорилировании транспортировать предшественника. Антибиотик не является высокоспецифическим и может подавлять некоторые другие реакции с участием бактопренола (например, синтез О-антигена липополисахарида).

К антибиотикам третьей группы (препятствующим образованию сшивок на поверхности мембраны) относят соединения двух больших

38

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

групп – гликопептидные и β-лактамные. Гликопептидные антибиотики синтезируются представителями различных редких родов актиномице-

тов: Amycolatopsis orientalis (ванкомицин), Actinoplanes teicomyceticus

(тейкопланин), Proactinomyces. Используются антибиотики для лечения тяжелых кокковых инфекций, являются бактерицидными.

Особенности структуры и механизма действия данных антибиотиков следующие:

•молекулы антибиотиков крупные (1500–2000 Д), в них имеется значительное число ароматических фенольных колец (у ванкомицина – 5, у других – 7), имеется гептапептидный хвост, необычные сахара (ванкозамин, ристозамин);

•действуют только на грамположительные бактерии, так как из-за больших размеров не способны проникать через наружную мембрану в клетки грамотрицательных бактерий;

•механизм действия связан непосредственно с взаимодействием с N-ацетилмурамилпентапептидом. В данном случае принципиально важно наличие двух концевых остатков D-аланина. Если хотя бы один из них замещен на L-форму, связывания не происходит. Три другие аминокислоты в пентапептиде не влияют на взаимодействие с антибиотиком. Из-за больших размеров молекулы антибиотика считают, что концевые остатки D-аланина как бы «проваливаются» в молекулу антибиотика. Следует отметить, что молекула антибиотика экранирует субстрат (D-аланин-D-аланин) от ферментов – транспептидаз и карбоксипептидаз.

Внастоящее время описаны несколько механизмов резистентности

кгликопептидным антибиотикам, касающихся в основном ванкомицина. Во-первых, это резистентность, обнаруженная у Enterococcus и связанная с наличием ряда белков. Синтез этих белков кодирует плазмида pIP 816, имеющая размеры 34 т.п.о. Важно, что детерминанты резистентности организованы в транспозон 1546, ограниченный инвертированными повторами, и, следовательно, способны передаваться между различными репликонами. В составе Tn 1546 обнаружены гены:

•van A, 1029 п.о., продуктом которого является специфическая D-ала- нин-D-аланин лигаза. Она характеризуется низкой специфичностью по сравнению с хромосомным геном, отвечающим за включение в пентапептид D-аланина, и может включать, наряду с аланином, D-лактат. В результате этого образуются концевые фрагменты со структурой D-аланин- D-лактат, которые не связываются с ванкомицином;

•van H, кодирующий специфическую дегидрогеназу для образования D-лактата, т. е. субстрата для ранее описанной реакции;

39