3 курс / Фармакология / Механизмы_биосинтеза_антибиотиков_и_их_действие_на_клетки_микроорганизмов

ферментов этих групп описаны несколько, обладающих бифункциональной активностью – фосфо- и ацетилтрансферазной. У исследованных штаммов стрептококков и стафилококков соотвествующий ген мог быть локализован как на конъюгативной, так и неконъюгативной плазмидах, а также хромосомально. Синтез ферментов такого рода обусловливают гены устойчивости в составе транспозонов Tn5, Тn1699, Tn 903 и др.

Аденилилтрансферазы (ААВ или ANT) разделены на пять различных типов. Ацетилтрансфераз (ААС) известно четыре типа, они обнаруживаются только у грамотрицательных бактерий, гены имеют плазмидную или хромосомальную локализацию. Ацетилированию могут подвергаться только дезоксистрептаминовые антибиотики.

Аминогликозиды относятся к препаратам с низким терапевтическим индексом, т. е. малым разрывом между терапевтической и токсической дозой или концентрацией. Такой эффект наиболее часто объясняют тем, что антибиотики являются поликатионами, а большинство биополимеров клетки – полианионы. In vitro показано взаимодействие аминогликозидов с фосфолипидами, липопротеинами, нуклеиновыми кислотами.

Существует модель, согласно которой в нервной ткани аминогликозиды взаимодействуют с полифосфоинозитидами – компонентами мембран. Это приводит к изменению проницаемости для различных катионов. Ототоксический эффект аминогликозидов (влияние на восьмую пару черепно-мозговых нервов и сопутствующая глухота при длительном применении) связывают с конкуренцией между аминогликозидами и катионами кальция за отрицательно заряженные фосфорные остатки. В некоторых случаях частота ототоксичности наблюдается в пределах 2–25 %. Ототоксический эффект не снимается при прекращении приема антибиотика, а его наличие зависит от индивидуальных особенностей и срока приема антибиотика.

Нефротоксический эффект и нейромышечная блокада (курареподобное действие) обусловлены взаимодействием аминогликозидов с клетками почечных канальцев и с актином. Нефротоксический эффект может сниматься при прекращении приема антибиотиков. Наиболее нефротоксичным является гентамицин. Указанные факты, а также развитие аллергических реакций и высокая частота возникновения резистентных форм, ограничивают использование аминогликозидов в клинике.

Тетрациклины – относительно небольшая группа химически весьма сходных соединений, состоящих из четырех конденсированных ароматических колец. Основная масса природных соединений этого класса обнаружена в 1948–1952 годах. Первым был выделен хлортетрациклин (S. aureofaciens), существует и другое его название – аурантин (ауреомицин), что свидетельствует об одном из его свойств – наличии золотистой окраски. Данный антибиотик под названием биовит используется в сель-

60

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ском хозяйстве как добавка в корм животных, что ускоряет рост, повышает привесы, снижает риск развития некоторых заболеваний. В 1952 году при культивировании S. rimosus был выделен тетрациклин, хотя в настоящее время антибиотик получают, выращивая продуцент хлортетрациклина в условиях, когда к образующемуся антибиотику не присоединяется атом хлора (при добавлении барбитала). Тетрациклины являются антибиотиками широкого спектра действия, бактериостатическими в лечебной дозе. Всего описано 35 соединений данной группы, в клинике для лечения пневмоний, скарлатины, кишечных инфекций, бруцеллеза используются 3–5. Существуют как природные, так и полусинтетические (доксициклин, метациклин) соединения.

Поскольку мишень для действия антибиотиков находится внутри клеток, встает вопрос о поступлении антибиотика в клетку. Первым барьером на этом пути является мембрана грамотрицательных бактерий. Тетрациклины – соединения в разной степени гидрофильные, поэтому принято считать, что канал OmpF у E. coli или аналогичные каналы у других бактерий – основной путь их поступления. Связывание с поверхностью микробной клетки, поступление через пориновые каналы и клеточную стенку не требует затрат энергии.

Гораздо более спорным и менее изученным остается вопрос о поступлении антибиотика через цитоплазматическую мембрану. Вывод о том, что поступление через мембрану является активным, энергозависимым процессом и осуществляется против градиента концентраций, основан, прежде всего, на том, что внутриклеточная концентрация антибиотика может в 10–100 раз превышать внеклеточную. Транспорт тетрациклина может быть связан с функционированием двух систем: протондвижущей и связанной с гидролизом фосфатной связи. Для некоторых бактерий (Staphylococcus, Streptococcus) показано, что компоненты системы транспорта являются термочувствительными и не функционируют при температуре 50–60 ºС, что указывает на возможную белковую природу переносчика. В отдельных случаях, учитывая сходство с оксалоацетатом и другими дикарбоновыми кислотами, рассматривают возможность поступления тетрациклина через систему транспорта С4 – дикарбоновых кислот.

Рассматривая механизм действия тетрациклина, следует сразу же указать на тот факт, что антибиотик может связываться и с 80S рибосомами, однако в клетках макроорганизма антибиотик не накапливается, и не создается такая его концентрация, которая была бы достаточной для ингибирования биосинтеза белка. Сходный эффект описан также и для фузидиевой кислоты. В бактериальных же клетках считается установленным фактом (расшифровка механизма началась с середины 1950-х годов), что тетрациклин является ингибитором элонгации белковой цепи и препятствует связыванию очередной аа-тРНК.

61

Предполагается, что фиксированная 30S субъединицей рибосомы молекула тетрациклина, возможно с участием катионов магния, находится в А-сайте и нарушает взаимодействие кодон – антикодон. Тетрациклин удерживается в связанном с рРНК состоянии за счет шести водородных, одной ионной связи, а также различных липофильных и слабых взаимодействий. Наиболее вероятно, что взаимодействие происходит в последовательности ГУ:ГЦ или ГЦ:АУ. Тетрациклин занимает участок, реагирующий с аминоацил-тРНК, фактором элонгации Tu и GTF. Связывание тетрациклина с рибосомой происходит в любом соотношении. На 30S субъединице обнаружено одно место специфического или сильного связывания, в результате которого блокируется биосинтез белка, и около 500 мест неспецифического связывания. В образовании места связывания антибиотика и рибосомы принимают участие минимум три белка (S7, S14, S19) и примерно 450 оснований 16S-рРНК. На 50S субъединице мест связывания тетрациклина не обнаружено.

Устойчивость к тетрациклину может являться следствием различных механизмов, а гены резистентности могут быть локализованы как в составе плазмид, так и хромосомально, могут организовываться в транспозоны. На рис. 5 представлены возможные последствия взаимодействия

стетрациклином клеток, различных по чувствительности.

Вчувствительные клетки тетрациклин проникает с участием активных переносчиков, и его концентрация в клетке становится выше, чем в среде, а молекула антибиотика воздействует на А-сайт 30S-субъединицы (рис. 5, а). При устойчивости, связанной с наличием системы выведения (efflux) антибиотика из клетки, существует белок цитоплазматической мембраны, который с затратами энергии удаляет антибиотик, и его концентрация становится ниже внеклеточной и недостаточной для связывания с рибосомами (рис. 5, б). Устойчивость на рибосомном уровне связана с модификацией рибосом, в силу чего антибиотик не может быть долгое время связан с ними (рис. 5, в). Наконец, устойчивость вследствие внутриклеточной модификации антибиотика связана с его переходом в неактивную форму (рис. 5, г). Измененный тетрациклин затем диффундирует из клетки. Существует также устойчивость, связанная с потерей пориновых каналов и отсутствием транспорта антибиотика в клетки грамотрицательных бактерий.

Устойчивость к тетрациклину у бактерий – довольно распространенное явление, поэтому его использование в клинике ограничено. В некоторых случаях клинические изоляты бактерий на 70–90 % являются устойчивыми к тетрациклину.

Для клиники принципиальное значение имеет устойчивость, связанная с системой активного выведения антибиотика из клетки, а по локализации соответствующих генов – связанная с плазмидами. Плазмиды с ге-

62

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

трациклина репрессор отделяется от ДНК, и обеспечивается транскрипция в разных направлениях соответствующих генов. Белок, кодируемый структурными генами, состоит из двух полипептидных цепей и локализован в мембране, его сверхпродукция приводит к неограниченной транслокации протонов через мембрану и, в конечном итоге, к гибели клеток.

Между генами, относящимися к различным классам (А – Е), существует определенная гомология (от 45 до 80 %). Следует отметить, что «гибридные» белки, содержащие С- или N-участки от белков различных классов (например, А/Е или С/В), проявляют в клетке защитный эффект в различной степени (от максимальной устойчивости до полного ее отсутствия).

У грамположительных бактерий аналогичный механизм резистентности обеспечивают детерминанты классов K и L, белковые продукты которых гомологичны примерно на 70 %.

Принципиально другой механизм резистентности обеспечивают детерминанты классов K – L, определяющие наличие белка, модифицирующего и защищающего рибосомы. Такие белки, обозначенные RP (ribosome protection), обнаружены у грамотрицательных, грамположительных и анаэробных бактерий. Сходство между белками незначительно. Белки, являющиеся продуктами этих генов, имеют молекулярную массу 68–70 Кд. Недавно пришли к заключению, что существует восемь классов таких белков, в состав этих классов входит также семейство белков otrA, найденных у штамма-продуцента антибиотика. На основании сходства аминокислотных последовательностей белки делят на четыре группы. Все белки имеют G-домен на N-концевом участке молекулы, который гомологичен таковому фактора EF-G и EF-Tu. Связываясь с рибосомами, белок препятствует связыванию с ними тетрациклина, но не аминоацил-тРНК. Экспрессия некоторых белков RP регулируется на уровне транскрипции.

Долгое время открытым оставался вопрос о наличии детерминант, связанных с образованием ферментов, инактивирующих тетрациклин. Следует отметить, что молекула тетрациклина является крупной, с двойными связями, и существует множество возможностей для ее окисления, восстановления и, следовательно, инактивации. Относительно недавно были обнаружены детерминанты, обеспечивающие функционирование механизма такого типа. Было показано, что при выращивании бактерий E. coli, в клетках которых резистентность обусловлена либо системой активного выведения антибиотика, либо ранее неизвестными причинами (детерминанты классов С и Х), в культуральной жидкости впоследствии

65

обнаруживаются соединения со спектрами поглощения, характерными для тетрациклина (364 нм) либо с измененными (258 нм). Выделенный в последнем случае белок ТЕТ Х имеет молекулярную массу 44 Кд, богат метионином. Он относится к типу НАДФ-оксидоредуктаз и неспецифически может окислять тетрациклин, также как и другие соединения с фенольной структурой, например лигнин.

Следует указать, что широкое распространение получило присутствие в одном и том же штамме детерминант нескольких различных типов. Это относится к представителям родов Enterococcus, Streptococcus.

Тетрациклин, и особенно его полусинтетическое производное доксициклин, широко используется в клинике. К его отрицательному действию можно отнести фототоксический эффект; способность связывать катионы кальция и тем самым нарушать формирование зубов и костей. Особенно вредно его использовать беременным женщинам и детям до 7– 8 лет.

Макролидные антибиотики относятся к соединениям, блокирующим процессы биосинтеза белка в области 50S субъединицы рибосом. Структура антибиотиков достаточно сложна, так как они содержат макроциклы из 14 (эритромицин, кларитромицин, олеандомицин); 15 (азалиды, сумамед, азитромицин) и 16 (спирамицин, джозамицин, тилозин) атомов углерода, к которым присоединяются нейтральные или аминосахара. Всего обнаруживается в составе различных антибиотиков пять различных амино- и 11 нейтральных сахаров. Известно около 100 природных и полусинтетических производных, которые обладают бактериостатическим действием, в основном против грамположительных кокков, редко – в отношении грамотрицательных бактерий. С клинической точки зрения данные антибиотики могут быть разделены на противобактериальные и противогрибковые (полиены). Первым обнаруженным в 1952 году соединением этой группы был эритромицин (S. erythreus = Saccharopolyspora erythraea). Следует отметить, что в последние годы были обнаружены и 12-членные макролиды, образуемые Penicillium и получившие название патулолиды, а также получены производные макролидов – кетолиды с весьма интересными для клиники свойствами.

Макролиды – крупные гидрофобные структуры, поэтому их поступление в клетки грамотрицательных бактерий ограничено, но если процесс происходит, то считают, что он обеспечивается наличием пориновых каналов. Через цитоплазматическую мембрану поступление антибиотиков происходит, вероятно, путем пассивной диффузии.

Проникая в клетку, антибиотик связывается с 50S субъединицей рибосомы, причем такое связывание обратимо и происходит за счет водо-

66

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

родных связей. Для связывания антибиотика обязательно наличие интактного лактонного кольца и хотя бы одного сахара. Макролид более активен обычно, если таким остатком сахара в молекуле является аминосахар. При взаимодействии эритромицина с 50S субъединицей в образовании места связывания участвуют и 30S субъединица, и 23S-рРНК. При определении места связывания за основу было взято определенное сходство участка (сахар + часть лактонного кольца) с участком пептидил-тРНК.

Современная концепция действия эритромицина на белковый синтез рассматривает антибиотик как аллостерический эффектор пептидилтрансферазы. Эффектор означает, что эритромицин может как подавлять, так и стимулировать образование пептидной связи. Основополагающим явился тот факт, что эритромицин не подавляет образование первой пептидной связи. Однако, если имеется хотя бы дипептид, наблюдается подавление данной реакции, т. е. Р-сайт должен быть занят пептидил-тРНК с определенной минимальной последовательностью аминокислот.

Эритромицин рассматривают и в связи с изучением транслокации пептидной цепи (т. е. при перемещении пептидил-тРНК из А- в Р-сайт; вытеснение из Р-сайта тРНК; перемещение мРНК). В системе in vitro (рибосомы E. coli, присутствие других ингибиторов белкового синтеза, тРНК с различными по длине пептидами) исследовалось влияние на белковый синтез эритромицина. Оказалось, что связывание эритромицина с рибосомой приводит к нарушению расположения в Р-сайте возвращающейся из А-сайта пептидил-тРНК. Возможно, что она располагается при этом даже не в Р-сайте, а рядом с ним. В результате этого не вытесняется в окружающую среду уже деацитилированая тРНК, а неправильное расположение пептидил-тРНК по отношению к Р-сайту обрывает функционирование системы. А-место на рибосоме не изменяется в присутствии эритромицина и может принимать тРНК.

Рибосомы эукариотических клеток макролиды не связывают, а митохондриальные рибосомы защищены мембраной, через которую они не проникают.

Внастоящее время описано несколько механизмов резистентности

кмакролидам. Следует учитывать природную резистентность у грамотрицательных бактерий за счет отсутствия поступления через наружную мембрану. Для E. coli описаны мутанты с повышенной резистентностью к эритромицину и другим макролидам за счет изменения некоторых белков 50S субъединицы. Это приводит к ослаблению способности рибосом связывать эритромицин. Считают, что как минимум шесть или семь белков участвуют в таком связывании.

Значительно больший интерес представляет MLS-резистентность (макролиды, линкозамины, стрептограмин), описанная для Staphylococ-

67

cus и Streptococcus. Гены, отвечающие за такой тип резистентности (ermгены), могут быть локализованы как на хромосоме, так и в плазмидах. Их насчитывается семь классов. Продуктом данных генов является специфическая метилаза, катализирующая метилирование определенных остатков аденина в 23S-рРНК. Например, у E. coli происходит диметилирование остатка А-2058 в петле V, включенного в перенос пептидильного фрагмента. Возможна также замена аденина в этом (или сходных положениях у других организмов) на другой нуклеотид. Количество метилированных остатков – 2–3 на молекулу. Индукция синтеза метилазы происходит обычным путем: антибиотик воздействует на регуляторный белок на уровне транскрипции. Индуцирующими могут быть бактериостатические концентрации любого из антибиотиков. Такой тип резистентности носит название диссоциирующей. Удаление индуктора приводит к потере MLS-резистентности. Проблема достаточно актуальна, так как в животноводстве часто используется тилозин, и в этих случаях наблюдалось повышенная частота выделения грамположительных бактерий с таким типом устойчивости.

Все большее распространение получает механизм резистентности за счет образования клетками инактивирующих макролиды ферментов, которые могут быть трех типов: фосфорилирующие или гликозилирующие молекулу и эстеразы, расщепляющие лактонное кольцо. Фосфорилирующие ферменты инактивируют лактонное кольцо в присутствии АТФ и магния; гликозилирующие нуждаются в УДФ-глюкозе как кофакторе. Особое внимание в последнее время уделяется эстеразам, которые впервые были обнаружены у Pseudomonas, E. coli. Считают, что проблема их распространения как факторов резистентности приобретает для клиники такое же значение, как и продукция лактамаз и аминогликозидинактивирующих ферментов. В настоящее время описаны два типа изоферментов – эстеразы I и II. Наконец, в последние годы у Staphylococcus обнаружен механизм, обусловливающий резистентность за счет энергозависимого выброса антибиотика из клетки, что сопровождается наличием в клетке плазмиды определенного типа.

Применение макролидов в клинике ограничено по двум причинам: они являются нейтральными или основными соединениями, поэтому наблюдается плохое всасывание в организме; вторая причина – широкое распространение устойчивых штаммов.

Бактериостатическое действие хлорамфеникола, выделенного в 1947 году и образуемого S. venezuellаe, основывается на ингибировании синтеза белка на 70S рибосомах. Показано, что антибиотик связывается с одним белком малой субъединицы и семью белками большой субъединицы. Хлорамфеникол ингибирует активность пептидилтрансферазы.

68

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Это антибиотик широкого спектра действия, хорошо всасывается из же- лудочно-кишечного тракта. Используется для лечения инфекций, вызываемых кокками, лихорадки Скалистых гор, сыпного тифа. Основное побочное действие – поражение костного мозга, анемия, лейкопения.

Устойчивость к хлорамфениколу определяется наличием фермента хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ). Этот фермент участвует в ацетилировании с помощью АсКоА гидроксильной группы антибиотика. САТ – тетрамер, состоящий из идентичных полипептидных цепей, каждая из которых участвует в образовании активного центра. У энтеробактерий обнаружены четыре типа САТ, которые различаются по электрофоретической подвижности, чувствительности к ингибиторам, серологическим свойствам. Например, штаммы энтеробактерий, устойчивые к хлорамфениколу и фузидиевой кислоте, содержат САТ I типа, и показано, что устойчивость к обоим антибиотикам кодируется одним и тем же геном. Это объясняют тем, что фермент имеет домен, который легко связывается с ароматическими соединениями, структурно не сходными с хлорамфениколом.

Надо отметить, что активные центры ферментов САТ всех четырех типов имеют сходные последовательности. Все ферменты энтеробактерий являются конститутивными, и синтез их детерминируется плазмидными генами.

Фузидиевая кислота, относящаяся к группе стероидных соединений, была выделена в 1960 году из культуральной жидкости гриба Fusarium coccidium. В первых исследованиях было показано, что антибиотик активен в отношении широкого круга грамположительных бактерий, особенно стафилококков, обладает низкой токсичностью.

Фузидиевая кислота in vivo и in vitro ингибирует синтез белка в про- и эукариотических клетках на том этапе, когда происходит транслокация, в результате чего рибосома передвигается относительно мРНК на один кодон (рис. 6). Рибосома содержит пептидил-тРНК в сайте А, деацетилированная тРНК находится в сайте Р и в процессе транслокации удаляется. Пептидил-тРНК передвигается из А- в Р-сайт, а рибосома, соответсвенно, на один кодон. Транслокация нуждается в факторе элонгации (транслоказе), который катализирует гидролиз ГТФ. Для этого образуется комплекс с ГТФ, который гидролизуется на рибосоме с высвобождением ГДФ, рибосомы и фактора G. Фузидиевая кислота стабилизирует этот комплекс и препятствует вследствие этого повторному использованию фактора элонгации G и ГДФ. На 80S рибосомах мишенью для действия является фактор элонгации 2, однако вследствие малой внутриклеточной концентрации антибиотика его токсическое действие не проявляется.

69