2.4.1.3.1Шоколадный агар для выделения и идентификации h.Influenzae

Состав: 2% мясопептонный агар (МПА), 10% крови и 5% дрожжевого экстракта от объема МПА, рН 7,4–7,6.

Приготовление. К охлажденному до температуры 75^оС МПА асептически добавляют половину необходимого объема крови, тщательно перемешивают и нагревают в течение 3–5 мин на водяной бане при температуре 80^оС, непрерывно помешивая. Затем остужают при комнатной температуре до 75^оС, добавляют вторую часть крови и снова нагревают в течение 3–5 мин, непрерывно помешивая. Остужают при комнатной температуре до 45–50^оС и добавляют дрожжевой экстракт. Агар тщательно взбалтывают и разливают по пробиркам и/или чашкам Петри.

Готовую питательную среду хранят в холодильнике, избегая высушивания, не более 2 нед.

2.4.1.3.2Шоколадный бульон

Основа – питательный бульон (рН 7,4–7,6). Приготовление аналогично приготовлению шоколадного агара.

Пример: на 180 мл питательного бульона добавляют 18 мл крови (9 мл эритоцитной массы и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота) и 9 мл дрожжевого экстракта.

2.4.1.3.3Двухфазная среда для посева крови и спинномозговой жидкости

Приготовление. Твердая фаза – шоколадный агар, разлитый и скошенный в стерильных флаконах в условиях бокса. Жидкая фаза – шоколадный бульон, асептично добавленный во флаконы с застывшим скошенным шоколадным агаром.

2.4.1.3.4Нтм агар

После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт до конечной концентрации 5 мг/мл и раствор гематина до конечной концентрации 15 мг/л. Для приготовления основного раствора гематина к 50 г порошка добавляют 100 мл 0,01N NaOH (0,01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения.

В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30 мл основного раствора гематина. После автоклавирования и охлаждения основы на водяной бане до температуры 45–50^оС в нее асептически вносят матричный раствор НАД 3 мл на 1 л агара до конечной концентрации 15 мг/л.

Для приготовления матричного раствора 50 мг НАД растворяют в 10 мл дистиллированной воды и стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм.

При тестировании триметоприма или ко-тримоксазола следует дополнительно асептически добавить 0,2 МЕ/мл тимидинфосфорилазы.

Приготовленный агар разливают в стерильные чашки Петри на ровном, строго горизонтальном рабочем столе. На чашку диаметром 100 мм необходимо 25 мл агара, диаметром 90 мм – 20 мл, для того чтобы толщина агара в чашке была 4±0,5 мм.

Агар застывает при комнатной температуре. Чашки с застывшим агаром необходимо подсушить с приоткрытыми крышками в термостате при температуре 35^оС в течение 10–30 мин, чтобы удалить из нее избыток конденсата.

2.4.1.4Среды, пригодные для культивирования m. Сatarrhalis

Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных данным возбудителем разработана, по нашему мнению, весьма условно. Тем не менее, по нашему практическому опыту мы преложили бы для выделения данного возбудителя все вышеперечисленные среды, с обязательным использованием теста на бета-лактамазу (диск с нитроцефином).

2.4.2Идентификация выделенных возбудителей

2.4.2.1S.pneumoniae

Принципы идентификации пневмококков

Идентификация пневмококков проводится на основании:

• морфологических особенностей роста;

• фенотипических характеристик;

• антигенной структуры (серологический метод).

Морфологическая характеристика

Гемолитическая реакция стрептококков на КА является отправной точкой в идентификации пневмококков. Различают 3 основных типа гемолитической реакции:

• альфа-гемолиз (частичный гемолиз эритроцитов) - зеленое окрашивание агара вокруг колонии;

• бета-гемолиз (полный гемолиз эритроцитов) - зона полного просветления вокруг колонии;

• гамма-гемолиз (или отсутствие гемолиза).

S.pneumoniae - альфа-гемолитический (зеленящий) стрептококк, который по морфологическим признакам роста трудно отличим от других альфа-гемолитических ("зеленящих") стрептококков - S.mitis, S.oralis, S.sanguis, S.parasanguis, S.gordonii.

Использование стереомикроскопа с увеличением 7 Х 2,5 позволяет увидеть характерные морфологические особенности роста пневмококка - сероватый оттенок колоний, выпуклую поверхность и влажную "сметанообразную" консистенцию, что существенно облегчает его идентификацию. При длительной инкубации (48 ч) центральная часть колонии может опускаться, давая характерную блюдцеобразную форму, что объясняется действием пневмококковых аутолизинов. Колонии некоторых штаммов могут полностью уплощаться, образуя поверхность "шляпки гвоздя".

Фенотипические методы идентификации

Дальнейшая идентификация S.pneumoniae проводится стандартными фенотипическими методами, основными из которых являются чувствительность к оптохину и лизис в присутствии солей желчи.

Чувствительность к оптохину

Принцип. Метод основан на способности оптохина (этилгидрокупреина гидрохлорида) селективно подавлять рост пневмококка в отличие от других зеленящих стрептококков.

1. Материалы: агар с добавлением 5% дефибринированной крови (основы см. раздел "Питательные среды");

2. диски, содержащие 5 мкг оптохина (оptochin test,"БиоМерье"; Taxo P, BBL).

Процедура. Произвести посев 1 колонии альфа-гемолитического стрептококка, подозрительного по морфологии на пневмококк, штрихом на сектор КА. Поместить диск с оптохином на засеянную поверхность и инкубировать в течение 18-24 ч при температуре 35^оС в атмосфере с 5-7% СО₂.

Интерпретация результата. Зона задержки роста >14 мм (диск диаметром 6 мм) или >16 мм (диск диаметром 10 мм) свидетельствует о наличии S.pneumoniae. Зона задержки роста <14 мм (<16 мм) требует подтверждения испытуемой культуры на принадлежность к S.pneumoniae в тесте лизиса в присутствии солей желчных кислот.

Ограничения метода. Примерно 4-5% пневмококков резистентны к оптохину, а рост некоторых "зеленящих" стрептококков подавляется оптохином (с образованием узкой зоны задержки роста).

Контроль качества. Цель: контроль качества дисков с оптохином. Контрольные штаммы: положительный контроль - S.pneumoniae ATCC 49619, отрицательный контроль - S.salivarius ATCC 13419 (или любой зеленящий стрептококк).

Методика постановки и интерпретация результатов соответствует описанной выше.

Лизис в присутствии солей желчных кислот

Принцип. Соли желчи (в особенности дезоксихолат натрия и таурохолат натрия) обладают способностью избирательно лизировать колонии S.pneumoniae на агаре или в бульоне. Метод основан на активации пневмококковых аутолизинов - ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки. Соли желчных кислот активируют аутолизины большинства штаммов, что приводит к визуальному лизису S.pneumoniae в течение 0,5-2 ч. Наиболее стандартизованным является пробирочный метод, который описан ниже.

Материалы. Существует несколько вариантов проведения теста лизиса в присутствии солей желчных кислот. Используется 10% раствор дезоксихолата натрия, приготовленный следующим образом:

• дезоксихолат натрия - 1 г;

• стерильная дистиллированная вода* - 9мл;

• рН - 7,0.

Раствор стерилизуется на водяной бане 5 мин. Хранится в холодильнике в темной емкости. При выпадении осадка (при снижении рН <6,5) реагент не пригоден для дальнейшего использования.

* Вместо дистиллированной воды можно использовать стерильный 0,9% раствор хлорида натрия или бульон с pH=7,4.

Процедура. Приготовить суспензию исследуемого штамма в 1-2 мл стерильной дистиллированной воды (или 0,9% раствора хлорида натрия) до мутности 1 по стандарту МакФарланда. Половину полученной суспензии перенести в другую пробирку, равную по диаметру.

К пробирке, маркированной словом "Тест", добавить 3-4 капли 10% раствора дезоксихолата натрия, а к другой, с маркировкой "Контроль" - 3-4 капли 0,9% раствора хлорида натрия. Тщательно встряхнуть пробирки и инкубировать 0,5-2 ч при температуре 35^оС, после чего следует визуально сравнить мутность микробной суспензии в 2 пробирках.

Интерпретация. Просветление жидкости в пробирке "Тест" по сравнению с пробиркой "Контроль" свидетельствует о принадлежности культуры к S.pneumoniae.

Ограничения теста. Примерно 86% пневмококков полностью лизируются в присутствии солей желчи. Для штаммов с неполным лизисом может потребоваться использование других тестов, например серологических.

Использование нативной, сухой или медицинской желчи не обеспечивает достоверных результатов, поскольку такая желчь не стандартизована по содержанию желчных кислот.

Контроль качества. Цель: контроль качества раствора дезоксихолата натрия. Контрольный штамм: положительный контроль - S.pneumoniae ATCC 49619, отрицательный контроль - S.salivarius ATCC 13419 или любой зеленящий стрептококк.

Методика постановки и интерпретация соответствуют описанной выше.

Альтернативные методы идентификации

Наряду с фенотипическими существуют альтернативные м етоды идентификации S.pneumoniae, самым распространенным из которых является серологический. Тест основан на выявлении пневмококковых капсульных полисахаридных антигенов с использованием поливалентной специфической пневмококковой сыворотки.

Имеются коммерческие диагностические наборы для выполнения латекс-агглютинационного теста, например "Slidex pneumokit" фирмы "биоМерье". Этот метод может использоваться для ускоренного выявления пневмококка непосредственно с чашки первичного посева.

Идентификация пневмококка методом латекс-агглютинации

Располагаем каплю латекса на стекле

Используем культуру S.pneumoniae (строго оксидазоотрицательную!!!), берем палочкой или петлёй (не менее 5 колоний), суспендируем их в капле латекса не менее 30 секунд и наблюдаем за появлением агглютинации не меньше, чем за одну –пять минут.

2.4.2.2Haemophilus influenzaе