2.3Микроскопия нативного материала

При поступлении на исследование мокроты особое внимание следует обратить на оценку качества доставленного образца. Критериями пригодности мокроты для бактериологического исследования является наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре, как минимум, 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (под увеличением Х100).

2.3.1Бактериоскопическая диагностика

S.pneumoniae- грамположительные, шаровидные бактерии (кокки), ланцетовидной формы, попарно расположенные по отношению друг к другу, причем в отличие от представителей рода нейссерий, которые также располагаясь попарно, напоминают скорее кофейное зерно, пневмококки в каждой паре сближены с одной стороны, и удалены друг от друга с противоположного конца, как бы удаляясь друг от друга (последнее замечание особенно характерно для микроорганизмов с хорошо выраженной капсулой).

При бактериоскопии мазка чистой пневмококковой культуры следует принять во внимание некоторую схожесть ее с чистой культурой стафилококка и микрококка. В случае необходимости, можно исследовать мазок чистой культуры, полученный из роста на шоколадном агаре (здесь пневмококки будут располагаться классически правильно, попарно, сближаясь при этом больше с одного конца, при окраске по Граму будут интенсивно синими.)

Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae- При окраске по Граму бактерии рода Haemophilus выглядят как мелкие, бледно окрашенные грам(–) палочки, иногда формирующие тонкие филаменты. Небольшие размеры, клеточный полиморфизм и недостаточное прокрашивание сафранином могут существенно затруднять обнаружение гемофильной палочки. Поэтому некоторые авторы предлагают наряду с окраской по Граму проводить окраску метиленовым синим. В этом случае микроорганизмы имеют синий цвет на серо-голубом фоне.

S.pyogenes- грамположительный микроорганизм, располагающийся цепочками различной длины, часто идущими параллельно друг к другу, свертывающимися в клубок , наподобие змейки. При бактериосокопии нативного мазка следует диффереенцировать его с дрожжевыми клетками в период деления.

Moraxella catarrhalis-представлены грамотрицательными диплококками (диаметром 0,6–1,0 мкм) с тенденцией противостоять обесцвечиванию, могут быть снабжены фимбриями, что обеспечивает им "дергающую" подвижность. Делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, поэтому иногда образуют тетрады.

Acinetobacter bumanii- грамотрицательные капсулированные палочки, при переходе в стационарную фазу приобретают «дергающуюся» подвижность, располагаются парами, короткими цепочками или полиморфно.

2.4Культуральная диагностика

Основными принципами культуральной диагностики таких прихотливых микроорганизмов, как возбудители инфекций нижних дыхательных путей, является изучение морфологических, фенотипических и др. признаков, при использовании, естественно, оптимальных для культивирования сред.

2.4.1Среды, оптимальные для культивирования

Основными принципами в подборе питательных сред для транспортировки и культивирования являются наличие аминного азота и обогащения углеводами.

2.4.1.1S.pneumoniae

• Использование приемлемых питательных сред. Пневмококк является "привередливым" микроорганизмом, требующим для роста на искусственных питательных средах высокого содержания аминного азота и нативного белка животного происхождения.

• Наличие в среде дефибринированной крови. Кровь необходима не столько для обогащения среды нативными белками, сколько для использования возможности идентификации гемолитической реакции пневмококка. Потребность пневмококка в белках может быть обеспечена добавлением сыворотки крови животных (лошади, барана), или с добавлением 5% дефибринированной крови барана, лошади, крупного рогатого скота или человека*. В России в ряде лабораторий имеется опыт использования эритроцитной массы из крови человека вместо дефибринированной крови.

Цитратная кровь непригодна для исследования.

• Инкубация в атмосфере c повышенным содержанием СО₂. Наиболее распространенным методом создания повышенной концентрации СО₂ является использование эксикатора, в который помещается зажженная свеча, которая при горении утилизирует кислород. Когда она гаснет, концентрация СО₂ достигает 3%. Однако наиболее эффективным является применение СО₂-термостата.

В качестве основы для приготовления кровяного агара (КА) используют колумбийский агар (Columbia agar), агар для бруцелл (Brucella agar), основу для КА (Blood agar base), эритрит агар, ГРМ-агар и др. Вероятность выделения пневмококка из мокроты увеличивается при использовании селективных сред, содержащих добавки, ингибирующие рост сапрофитных грамотрицательных микроорганизмов (нейссерий, гемофильных палочек и др.)..

Основные транспортные среды:

• Триптозно-фосфатный бульон;

• Триптон-соевый бульон без декстрозы;

• Бульон Тодда-Хьюита;

• Транспортная среда Стюарта;

Основные среды, используемые для выделения пневмококка:

• Кровяной агар (5-10%) на основе 1% питательного агара ;**

• Кровяной агар (5-10%) на основе 1,5% питательного агара;**

• Кровяной агар на основе колумбийского агара (5-10%) CNA;

• Шоколадный агар на основе 1,5% питательного агара CNA;

• Шоколадный агар на основе колумбийского агара CNA;

• Кровяной агар (5-10%) на основе триптозо-кровяного агара;

Среды, пригодные для выделения пневмококка :

• Агар с печеночной вытяжкой;

• Агар с печенью и телятиной;

• Кровяной агар на основе агара Мюллер-Хинтона;

• Бульон Мюллер-Хинтона;

• Основа гонококкового агара;

• Декстрозно-крахмальный агар;

• Цистинно-сердечный агар;

• Среда вареное мясо (Cooked Meat Medium);

• Агар с мозгово-сердечной вытяжкой;

• Агар с картофельной вытяжкой;

Основные селективные добавки:

• Лошадиная сыворотка (5-10%);

• Гентамицин микробиологический в конц. 5 мг/л;

• CNA коммерческая добавка (колистин, налидиксовая кислота);*

• Селективная добавка для выделения пневмококков №4 (Санкт-Петербург);

• Дрожжевой экстракт;

• Налидиксовой кислоты – 7,5 г;

• Колистина сульфат – 5,0 г.

Примечание:

*Добавка CNA для селективного выделения пневмококков: на флакон для 500 мл среды-

**Только с селективными добавками!!!

Консервирующей средой для чистой культуры пневмококка может служить тиогликолевая среда.