Йодометрический метод определения пенициллиназной активности микроорганизмов в бульоне.

Принцип: взаимодействие бактериальной пенициллиназы с пенициллином, содержащимся в питательной среде, сопровождается расщеплением антибиотика с образованием 6-аминопенициллиановой кислоты, которая обесцвечивает соединение крахмала с йодом.

Классический метод: на чашки с суточными культурами наливают 10 мл (1,5% голодный агар+ 0,5% растворимый крахмал+ 5000 ед/мл пенициллин).Чашки на 1 час в термостат при температуре 37 градусов, после чего на поверхность среды наливают 5 мл раствора йода в 0,01 н концентрации. Результат: вокруг пенициллиназоактивных колоний –бесцветные кольцевидные зоны на синем фоне , тогда как при пенициллиназонегативных колониях- сохраняется синий фон.

Метод в бульонной культуре. В бульонную культуру (2 мл), предварительно убитую кипячением при 100 градусах в течение 2 минут (в основном для грамотрицательных культур, продуцирующих амилазу, чтобы нейтрализовать ее бета-компонент); наливаем реактив (0,5%растворимый крахмал+ 0,1 мл пенициллин 5000 ед/мл), инкубируем 25 минут-1 час (в зависимости от культуры) в термостате при 37 градусах, затем добавляем 1 каплю йода. Результат: регистрируем в первые 1,5 минуты: пенициллиназонегативные колонии – окраска раствора дожна остаться синей (культура, крахмал + йод, пенициллин в конц.5000 ед/мл), пенициллиназоположительные культуры: (культура, крахмал +йод, пенициллин+пенициллиназа=6-аминопенициллановая кислота, обесцвечивающая раствор. )

Преимущество: 1)значительная экономия реактивов;

2) ускорение сроков определения пеницилиназ;

3) возможность по титру крахмал-йодного реактива определить фактический уровень выработки пенициллиназы, что позволяет в практической деятельности обойтись без дорогостоящих нитроцефиновых дисков.

Контроль: 1)культура + крахмал +йод=синяя

2)Культура+ пенициллин+ крахмал +йод= синяя или бесцветная в зависимости от культуры

3)Крахмал+йод=синяя

Приложение 2