3 курс / Патологическая физиология / Патофизиология_крови,_Фред_Дж_Шиффман

Общий путь. Завершение процесса активации свертывания крови называется общим путем (рис. 6-6). В этой стадии ФХа связан с ФУа на фосфолипидной поверхности и в присутствии Са2+ (так называемый протромбиназный комплекс) превращает протромбин (ФП) в тромбин (ФПа).

Протромбин — наиболее распространенный фактор свертывания крови в плазме из всех, зависимых от витамина К. Он синтезируется гепатоцитами как пре-пропептид. Посттрансляционные процессы модифицируют препротромбин в зрелую молекулу посредством карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты и встраивания углеводных боковых цепей. Зрелая молекула протромбина содержит 4 домена: первыедва связываются с ионамикальция ифосфолипидом; третий, видимо, также вовлечен в связь с кальцием, а четвертый содержит активный предшественник сериновой протеазы (рис. 6-7).

Активация протромбина в тромбин может происходить различными путями. Физиологически наиболее важный путь — за счет действия протромбиназного комплекса(ФХа+ ФУа+ фосфолипид+ Са2+). Протромбиназарасщеляетпротромбин в двух местах (Arg 320 и Arg 271). Преобладающими продуктами расщепления являются а-тромбин (аминокислотные остатки 272-579) и протромбиио-вый фрагмент 1.2 (аминокислотные остатки 1-271; рис. 6-7). ФХа в присутствии ионов кальция без ФУа способен расщеплять протромбин в тех же точках (в обратном порядке), но со значительно меньшей скоростью (в 300 000 раз). Сам тромбин может расщеплять протромбин по аминокислотным остаткам 155 и 284.

Неактивный предшественник фактора V циркулирует в плазме в видеодиночного полипептида, асимметричного гликопротеина. Он синтезируется в печени и мегакариоцитах, причем первый впоследствии превращается в ФУ плазмы, а второй — в тромбоцитарный ФУ.

Взаимодействие ФУ с протромбином обеспечивается с помощью тромбоци-тарного скелета на участке плазматической мембраны, связывающем все элементы протромбоцитарного комплекса (рис. 6-6). ФУ служит рецептором для при-

Рис. 6-7. Протромбипазный комплекс расщепляет протромбин в указанных аминокислотных сайтах. Фрагмент 1.2 и а-тромбин являются результатом расщепления между аминокислотами 271— 272. Сам тромбин расщепляется в сайтах 155 и 284

крепления ФХа к активированным тромбоцитам в месте повреждения. ФУа также связывается с протромбином, облегчая взаимодействие ФХа и протромбина. Анализ кДНК ФУ показывает, что его доменная структура аналогична структуре ФУШ, представленной выше (рис. 6-5). Ген ФУ локализован на хромосоме 1. ФУ превращается в активный кофактор (ФУа) за счет ограниченного протеолиза тромбином и фактором Ха. Тромбин удаляет домен В, превращая одноцепочеч-ный полипептид ФУ в двухцепочечный ФУа.

Связывание ФУа с тромбоцитарной фосфолипидной мембраной или клеточной поверхностью происходит при участии ЫНг-конца легкой цепи. Оказавшись на клеточной поверхности, ФУа действует как часть рецептора ФХа. Чтобы этот связывающий сайт функционировал, ФУа должен содержать интактные легкие

итяжелые цепи. ФУ осуществляет бинарное взаимодействие с каждым компонентом протромбиназного комплекса. Затем ФУа, связанный с мембраной, изменяет конформацию и ориентацию как фермента, так и субстрата. Хотя фосфоли-пид является подложкой, на которой происходит концентрирование фермента и субстрата, однако именно ФУа значительно ускоряет конверсию протромбина в тромбин при участии ФХа (рис. 6-6).

Тромбин вызывает гидролиз фибриногена до фибрина (рис. 6-8). Фибриноген (Мг 340 000) представляет собой сложный гликопротеин, состоящий из трех пар неидентичных полипептидных цепей: 2 а-, 2 |3- и 2 у-цепи. Это — продукт 3 генов, каждый из которых кодирует одну из разновидностей полипептидных цепей. Гены сгруппированы вместе на длинном плече хромосомы 4. Фибриноген синтезируется в основном гепатоцитами, но имеется в мегакариоцитах и тромбоцитах. Его синтез индуцируется повреждением тканей, воспалением, стрессом (состояниями острой фазы). Фибриноген играет важную роль в нормальном гемостазе, а также задействован в процессах при нарушенном гемостазе. Таким образом, кровотечение или тромбоз — обычные проявления или качественных, или количественных изменений в фибриногене.

Тромбин прежде всего расщепляет аргинин-глициновые связи фибриногена с образованием двух пептидов (фибринопептид А — ФПА и фибринопептид В — ФПВ)

имономера фибрина (рис. 6-6). Эти мономеры образуют полимер, соединяясь бок в бок (фибрин I), и удерживаются рядом водородными связями (растворимые фибриновые комплексы). Последующий гидролиз этих комплексов при действии тромбина приводит к выделению ФПВ. Кроме того, тромбин активирует ФХШ, который в присутствии ионов кальция связывает боковые цепи полимеров (лизин с глутаминовыми остатками) изопептидными связями. Между мономерами возникают многочисленные перекрестные связи, создающие сеть, взаимодействующих фибриновых волокон (фибрин II), весьма прочных и способных удерживать тромбоцитарную массу на месте травмы (рис. 6-8 и 6-15).

Биологические функции тромбина. Помимо образования фибрина, тромбин активирует тромбоциты, факторы и профакторы коагуляции, действует за пределами механизма свертывания крови (рис. 6-9). Тромбин активирует фибриноли-тическую систему, стимулирует ЭК и лейкоциты. Он также вызывает миграцию лейкоцитов и регулирует тонус сосудов. И наконец, стимулируя рост клеток, способствует репарации тканей.

Некоторые общие характеристики факторов свертывания крови представлены в табл. 6-2. Активность факторов I—XIII можно измерить в плазме. Плазма приготавливается с добавлением связывающего кальций вещества (например,

РЭС; протеолитическое действие тромбина (механизм обратной связи); ингиби-j торы сериновых протеаз; фибринолиз.

Кровоток и гемодилюция. При быстром кровотоке происходит разбавление ак-1 тивных сериновых протеаз и транспорт их в печень для утилизации. Кроме того, I диспергируются и отсоединяются периферические тромбоциты от тромбоцитар-1 ных агрегатов, что ограничивает размер растущей гемостатической пробки.

Клиренс печенью и РЭС. Растворимые активные сериновые протеазы инактиви-1 руются и удаляются из кровообращения гепатоцитами и ретикулоэндотелиаль-1 ными клетками печени (купферовскими клетками) и других органов.

Протеолитический эффект тромбина. Тромбин ускоряет отложение фибрина! на месте повреждения ткани за счет усиления активации факторов XI, V, VIII (рис. 6-2). Однако тромбин также может и ограничивать гемостаз. Он вызывает] протеолиз и деградацию факторов XI, V, VIII (рис. 6-2), что облегчает их инакти-1 вацию соответствующими ингибиторами и быстрый клиренс. Тромбин обеспечивает гемостатический контроль, инициируя активацию фибринолитической системы посредством белка С. Это неизменно приводит крастворению фибрина и| в томчисле

— за счет стимуляции лейкоцитов (клеточный фибринолиз).

Ингибиторы активных сериновых протеаз. Процесс свертывания крови строго контролируется присутствующими в плазме белками (ингибиторами), которые ограничивают выраженность протеолитических реакций и обеспечивают защиту | от тромбообразования.

Главными ингибиторами факторов свертывания крови являются антитромбин III I (AT III), гепариновый кофактор II (ГК II), протеин С (ПС), протеин S (ПБ), инги-1 битор пути тканевого фактора (ИПТФ), протеаза нексин-1 (ПН-1), С1-ингибитор, cti-антитрипсин (агАТ) и а2-макроглобулин (сс2-М). Большинство этих ингибиторов, за исключением ИПТФ и а2-М, принадлежит к суперсемейству белков, гомологичных ингибитору aj-протеазы, и называется серпины. Термин "серпин" (serpin) образован из слов "senneprotease inhibitor" — "ингибитор сериновой протеазы".

Механизм, лежащий в основе действия большинства ингибиторов протеаз, связан с образованием прочного стехиометрического комплекса с протеазой и последующим медленным гидролизом ингибитора и быстрым гидролизом слабо связанного субстрата. У серпинов иной механизм ингибирования — это результат' взаимодействия между субстратсвязывающим участком активированного фактора свертывания крови и активным центром ингибитора. Вследствие такого взаимодействия блокируется активный центр фермента (без гидролиза в активном центре ингибитора) и сериновая протеаза не вступает в протеолитическую реакцию. Функция ингибиторов in vivo сводится к ограничению активации свертывания крови за счет быстрого образования комплексов с сериновыми протеазами. Этот процесс предупреждает системную амплификацию активации свертывания крови

иограничивает коагуляцию зоной повреждения.

Всоответствии с механизмом действия ингибиторы свертывания крови подразделяются на группы: 1) серпины (AT III, ГК II, ПН-1, С1-ингибитор, а,-АТ); 2) кунины (ИПТФ), которые представляют собой белки, гомологичные апроти-нину

(ингибитор панкреатического трипсина); 3) сс2-макроглобулин, ингибитор-"мусорщик" (активный центр сериновой протеазы не участвует в образовании комплекса с а2-М).

Серпины

Антитромбин HI (AT III) является серпином и основным ингибитором тромбина, ФХа и Ф1Ха. Он также инактивирует ФХ1а и ФХНа. AT III нейтрализует тромбин и другие сериновые протеазы посредством ковалентного связывания. Врезультате формируется неактивный 1 : 1 стехиометрический комплекс между ферментом и ингибитором путем образования связи аргининсодержащего активного центра AT III и активного серинового центра тромбина (рис. 6-10). Скорость нейтрализации сериновых протеаз антитромбином III в отсутствии гепарина (антикоагулянта) невелика и существенно увеличивается в его присутствии (в 1000-100 000 раз).

AT III представляет собой а2-гликопротеин (Мг 580 000), синтезирующийся в печени. Его называют также гепариновым кофактором I. Гепарин имеет два сайта связывания сAT III, а тромбин — один. Гепарин связывается с лизиновымиостатками на AT III, что делает аргининовый активный центр более доступным для активного серинового центра тромбина. Связывание гепарина с AT III ускоряет образование комплекса тромбин-AT Ш-гепарин. Ковалентная связь между активным сериновым центром тромбина и аргининовым сайтом комплекса AT Ш-гепарин вызывает инактивацию активной сериновой протеазы.

После образования комплекса между AT III и тромбином гепарин диссоциирует из комплекса и связывается с другой молекулой AT III, генерируя множественные циклы инактивации фермента. Нейтрализация активированных форм иных факторов свертывания крови посредством AT III происходит по аналогичному механизму, но скорости инактивации различны. Для катализа ингибирования ФХа достаточно, чтобы гепарин связался только с AT III. Но чтобы катализиро-

Рис. 6-10. Взаимодействие AT III с факторами Па, Ха и 1Ха без гепарина и с гепарином. Не представлен фактор ХПа, который также инактивируется AT III. (AT III — антитромбин III; L

— места связывания лизина; * — аргининсодержащий активный центр AT III; сериновая протеаза (На, Ха, 1Ха); ** — серинсодержащий протеазный центр.)

вать ингибирование тромбина гепарин должен связаться и с AT III, и с тромбином

(ФИа) (рис. 6-10).

Облегчение взаимодействия между AT III и активными ферментами свертывания крови может быть опосредовано другими мукополисахаридами и гепарин-сульфатом. Поскольку эти вещества присутствуют в сосудистой стенке, предполагается, что они играют определенную роль в контроле процесса активации свертывания крови. Значение AT III как основного модулятора гемостаза подтверждается наличием тенденции к тромбообразованию у лиц с врожденным или' приобретенным дефицитом AT III.

Гепариновый кофактор II (ГКII) — серпин, ингибирующий тромбин, но не другие коагуляционные протеазы в присутствии гепарина или дерматан-сульфата. ГК II секретируется печенью в кровоток, где он циркулирует в течение примерно; 2,5 дней, но комплексы ГК Н-тромбин выводятся значительно быстрее с участием рецептора для комплекса серпин-фермент на гепатоцитах. Ингибирующее воздействие ГК II на тромбин менее выражено по сравнению с таковым у AT III. ГК II находится преимущественно во внесосудистом пространстве, где локализуется дерматан-сульфат, и именно здесь может играть решающую роль в ингибировании тромбина. Тромбину присущи и иные функции, не связанные со свертыванием крови или активацией тромбоцитов: пролиферация фибробластов и других клеток, индуцирование хемотаксиса моноцитов, облегчение адгезии нейтрофилов к ЭК, стимуляция образования простациклина и прочих медиаторов эндотелиальными клетками, ограничение повреждения нервных клеток (рис. 6-9). Способность ГКП блокировать эту деятельность тромбина играет определенную роль в регулировании процессов заживления ран, воспаления или развития нервной ткани.

Протеаза нексин-1 (ПН-1) — серпин, еще один вторичный ингибитор тромбина, предотвращающий его связывание с клеточной поверхностью.

а.-!-Антитрипсин (агАТ) нейтрализует ФХ1а и активированный протеин С

(АПС).

С1-ингибитор (Cl-И) также является серпином и главным ингибитором се-риновых ферментов контактной системы. Он нейтрализует 95 % ФХПа и более 50 % всего калликреина, образующегося в системе кровообращения, а при его дефиците возникает ангионевротический отек. ФХ1а в основном нейтрализуется а,-АТ и AT III.

Протеин С (ПС) — витамин К-зависимый белок, синтезируемый гепатоцита-ми. Циркулирует в крови в неактивной форме. Состоит из легкой цепи (с доменом, содержащим глутаминовую кислоту и двумя доменами, подобными эпидер-мальному фактору роста) и тяжелой цепи (домен сериновой протеазы). Протеин С (при участии остатков глутаминовой кислоты) связывается с поверхностью ЭК посредством кальциевых мостиков.

ПС активируется небольшим количеством тромбина. Эта реакция значительно ускоряется тромбомодулином (ТМ), поверхностным белком ЭК, который связывается с тромбином (рис. 6-11). Взаимодействие между тромбином и тромбомодулином, видимо, опосредовано другим белком — витронектином. Тромбомодулин обеспечивает 60 % сайтов связывания тромбина на ЭК. Тромбин в комплексе с тромбомодулином становится антикоагулянтным протеином, способным активировать сериновую протеазу — ПС. Комплекс тромбин-тром-бомодулин интернализуется ЭК, где тромбин разрушается, а тромбомодулин возвращается к поверхности.

ный ПС ингибирует свободный ФУа, но не связанный с ФХа. Однако в присутствииIIS (кофактор ПС-активации) происходит ингибирование каксвободного, так и связанного ФУ, что усиливает антикоагулянтный эффект АПС. Активность АПС контролируется собственным циркулирующим плазменным ингибитором (АПС-И) и а,-АТ.

Нарушение активации ПС возникает при патологических состояниях, обусловленных наличием таких факторов, как гипоксия, эндотоксин, ИЛ-1, ФНО-а и высоким уровнем гомоцистеина. Известно, что все они ускоряют свертывание крови, индуцируя экспрессию тканевого фактора эндотелиальными клетками и подавляя транскрипцию тромбомодулина.

Активированный ПС посредством механизма обратной связи подавляет продукцию ЭК ингибитора активатора плазминогена-1 (ИАП-1), оставляя без контроля ТАП. Это косвенно стимулирует фибринолитическую систему и усиливает антикоагулянтную активность АПС (рис. 6-11).

ПС и nS являются важными модуляторами активации свертывания крови, и их врожденный дефицит связан со склонностью к тяжелым тромботическим нарушениям. Клиническое значение системы ПС доказывает повышенное тромбо-образование (тромбофилия) у лиц с врожденной патологией ФУ. Аномалия молекулы ФУ (т. н. ФУ Лейден) характеризуется резистентностью к инактивации, связанной с действием АПС. Мутация в гене ФУ (замена гуанина 1691 аденином) приводит к замещению аргинина глутамином в позиции 506 аминокислотной последовательности белка. Такая патология ФУ устраняет сайт, по которому происходит расщепление активированным протеином С, что мешает инактивации ФУ и способствует возникновению тромбоза.

Кунины

Куниновые ингибиторы представляют собой суперсемейство белков, гомологичных апротинину, который называют также ингибитором панкреатического трипсина. Они содержат один или несколько куниновых доменов. Этот домен состоит из 58 аминокислотных остатков (он значительно меньше серпиновых доменов) Для кунинов характерна строгая ориентация остатков цистеина. В противоположность серпинам, структуру которых не определяют дисульфидные связи, активность кунинов зависит от правильного образования 3-х дисульфидных мостиков на 1 домен. Из всех ингибиторов сериновых протеаз крови только ингибитор пути тканевого фактора (ИПТФ) является ингибитором кунинового типа. .ИПТФ — это ФХа-зависимый ингибитор комплекса ФУПа-ТФ (рис. 6-12).

Ингибитор пути тканевого фактора — это гликопротеин (40 кД), состоящий из кислого аминокислотного остатка, трех куниновых доменов и основной СООН-концевой области. Ингибиторная активность ИПТФ обусловлена первым и вторым куниновых доменом. Первый связывается с комплексом ТФ-ФУНа, второй— с ФХа; третий — с липопротеинами и не обладает ингибиторной активностью. ИПТФ в основном синтезируется эндотелиальными клетками и в меньшей степени — мононуклеарными клетками и гепатоцитами. ИПТФ распределен в трех внутрисосудистых пулах: 50-90 % в ЭК, 10-50 % в плазме и 2,5 % — в тромбоцитах. Плазменный пул главным образом связан с липопротеинами и лишь 5 % циркулируютв свободном состоянии. Однако ингибиторная активность обусловлена

свободным ИПТФ.

Инактивация посредством ИПТФ происходит в 2 стадии. Сначала ИПТФ связывается с ФХа и инактивирует его (1:1 стехиометрический комплекс) при отсутствии ионов кальция; затем комплекс ИПТФ-ФХа связывается с комплексом ТФ-ФУПа и инактивирует его, образуя кальцийзависимый четвертичный ингибиторный комплекс (рис. 6-12). Нефракционированный гепарин, фракционированные гепарины (гепарины с низкой молекулярной массой) и пентозан-по-лисульфат стимулируют выделение ИПТФ и усиливают его антикоагулянтную активность. Ускорение ингибирующего действия ИПТФ за счет гепариновых соединений и аффинности гепарина к ИПТФ расценивается как причина проти-восвертывающих свойств эндотелия, содержащего молекулы гепаринового семейства. Ингибируя небольшие количества ТФ, ИПТФ играет важную роль в поддержании нормального гемостаза.

Фибринолиз. Конечная стадия в репаративном процессе после повреждения кровеносного сосуда происходит за счет активации фибринолитической системы (фибринолиза), что приводит к растворению фибриновой пробки и началу восстановления сосудистой стенки (рис. 6-15). Фибринолиз — основной эндогенный механизм, предотвращающий тромбообразование. Существуют 2 главных компонента фибринолиза: фибринолитическая активность плазмы и клеточный фибринолиз.

Путь тканевого фактора и его инактивация при помощи ингибитора

Рис. 6-12. Двухфазный процесс инактивации ФХа и ФУНа посредством ИПТФ (подробное описание в тексте)