6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Успехи геронтологии 2011 №01. Том 24

скими заболеваниями; гинекологическая заболеваемость среди девочек за последние 5 лет выросла в 1,5 раза, что обусловлено ранним началом половой жизни, родами, абортами, инфекциями, передающимися половым путем. В то же время, Россия лидирует по числу абортов — 1 млн 610 тыс. в 2004 г., при этом около 10 % абортов производится в подростковом возрасте. Доля бесплодных браков в стране — более 15 %; зарегистрировано 5,5–6,5 млн женщин и около 4 млн мужчин, страдающих бесплодием. Сохраняется низкий уровень рождаемости — 9,8 на 1 тыс. населения (2002 г.), 10,4 (2004 г.), 10,2 (2005 г.), что далеко от рубежа простого воспроизводства населения, а число повторных рождений снизилось с 51 до 41 %. Общая смертность населения остается высокой — 16,1 на 1 тыс. населения, что в 1,6 раза выше рождаемости [21]. Таким образом, налицо все механизмы, способствующие феномену «стоп-эволюция».

Под руководством С. П. Боткина в 1889 г. было проведено широкое обследование более 2,5 тыс. пациентов богаделен Санкт-Петербурга [17]. И если проанализировать эти данные с современных позиций, можно обнаружить весьма интересные закономерности. Так, акселерация проявила себя тем, что приход менархе оказался во времена Боткина на 5 лет позже, чем в конце XX в. [15]. Если в 1889 г. на 2600 обследованных лиц пожилого и старческого возраста было зарегистрировано три случая диабета (0,04 %), то в конце XX в. распространенность диабета в старших возрастных группах достигла 25 % [53]. Детей в 1889 г. было, в среднем, на одну мать от 2 до 5, долгожительство в семье (наличие лиц, проживших более 60 лет) достигало 45 %, практически отсутствовали проблемы со сном (бессонницей страдали лишь 23 лица из 2600!), число девиц в преклонном возрасте было 32 % (при нынешнем снижении возраста дефлорации до 15 лет) [39].

Заключение

Таким образом, можно считать доказанным феномен ухудшения качества первичного здоровья во второй половине ХХ и начале ХХI в., что должно неминуемо привести к снижению резервов потенциального увеличения продолжительности жизни и потенциально способствовать ее укорочению.

Для преодоления данного «кризиса геронтологии», по-видимому, необходим междисциплинарный подход, включающий совместные исследования с последующей выработкой рекомендаций, с

участием не только геронтологов/гериатров, но и педиатров, андрологов/гинекологов, эндокринологов, генетиков, экологов и социологов.

Социальная составляющая проблемы, подчеркивающая роль общества и внешней среды в физиологии и патологии человека, ее некоторая «политизированность» не может быть неожиданной для геронтологии, традиционно развивающей раздел социальной геронтологии. И задача, по-видимому, состоит лишь в большем сближении различных геронтологических дисциплин, в том числе социальных, клинических и фундаментальных.

Главный практический вывод, который хотелось бы сделать, состоит в том, что очевидный ранее вопрос о необходимости превентировать процессы старения в более ранние возрастные периоды необходимо перевести в реальную плоскость, и, как минимум, клиническим геронтологам включить в круг своих пациентов лиц среднего возраста. И во-вторых, геронтологам необходимо шире взаимодействовать с врачами других специальностей, определяющих первичное здоровье будущего пациента гериатрической клиники.

Литература

1.Анисимов В. Н. Молекулярные и физиологические ме-

ханизмы старения. СПб.: Наука, 2003.

2.Базарный В. Ф. Школьный стресс и демографическая катастрофа в России. Сергиев посад, 2004.

3.Берштейн Л. М. Онкоэндокринология курения. СПб.:

Наука, 1995.

4.Близнюченко А. Г. Близнецы из пробирки. Киев: Урожай, 1971.

5.Борисов В. А. Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде. М.,1990.

6.Брехман И. И., Нестеренко И. Ф. Природные комплексы биологически активных веществ. Л.: Наука, 1988.

7.Важдаева Н., Седлов Д., Семенова Е. Маленькие

мамы // Новые известия. 2007. 20 марта.

8.ВОЗ. Электромагнитные поля и общественное здравоохранение. Гиперчувствительность к электромагнитным по-

лям. Информационный бюллетень № 296. Декабрь 2005.

9.ВОЗ. Электромагнитные поля и общественное здравоохранение. Воздействие полей крайне низкой частоты. Информационный бюллетень № 322. Июнь 2007.

10.ВОЗ. Доклад о состоянии здравоохранения в мире: первичная медико-санитарная помощь сегодня актуальнее,

чем когда-либо. Женева, 2008.

11.Гершензон С. М. Генетический полиморфизм в популяциях животных и его эволюционное значение // Журн. общ.

биол. 1974. Т. 35. № 5. С. 678–684.

12.Гончаров Н. П. Эндокринные дисраптеры и репродуктивная функция // В сб.: Материалы IV Всероссийского кон-

гресса эндокринологов. СПб., 2001. С. 525.

13.Дворкин А. Сектоведение. Тоталитарные секты, опыт

систематического исследования. Н. Новгород: Христианская библиотека, 2006.

14.Дильман В. М. Четыре модели в медицине. Л.:

Медицина, 1887.

15.Жуковский М. А., Лебедев Н. Б., Семичева Т. В. и др.

Нарушения полового развития. М.: Медицина, 1989.

16.Иванов А. Н. Философия научения человека культу-

ре // Вестн. ОГУ. 2002. № 2. С. 28–33.

17.Кадьян А. А. Население С-Петербургских градских богаделен. Материалы к изучению старости по исследованию,

произведенному под руководством С. П. Боткина в 1889 году.

СПб., 1890.

18.Кафедра факультетской терапии / Под ред. А. Н. Бог-

данова, В. И. Мазурова. СПб.: ВМедА, 2006.

19.Киселев А. В., Худолей В. В. Отравленные города. М.: Greenpeace, 1997.

20.Кон И. С. Введение в сексологию. М.: Медицина, 1988.

21.Кулаков В. Роль охраны репродуктивного здоровья

населения России в решении демографических проблем //

Врач. 2006. № 9. С. 3–4.

22.Лутохин М. И. Исторический обзор литературы о расо-

вых различиях таза. М., 1899.

23.Министерство здравоохранения РФ. Приказ № 457.

Осовершенствовании пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей. 28 декабря 2000 г.

24.Мошков В. А. Новая теория происхождения человека и его вырождения. Варшава, 1907.

25.Оден М. Кесарево сечение: безопасный выход или

угроза будущему? М.: МШТА, 2006.

26.Один В. И. Аутоиммунный сахарный диабет. СПб.:

ВМедА, 2003.

27.Один В. И., Беликова Т. В. Ухудшение качества первичного здоровья у больных диабетом, рожденных в первой половине XX в. // Вестн. Рос. ВМА. 2008. № 3 (прилож. 2). Ч. 2.

С. 481.

28.Панарин А. С. Философия политики. М.: Новая школа,

1996.

29.Прохоров Б. Б., Горшкова И. В. Кризисы обществен-

ного здоровья в России и СССР в XX в. // Мир России. 1999.

№ 4. С. 125–137.

30.Радиация. Дозы, эффекты, риск. М.: Мир, 1990.

31.Рищук С. В., Мирский В. Е. Состояние здоровья детей и особенности течения беременности после применения вспомогательных репродуктивных технологий // Terra Medica. 2010. № 1. С. 34–37.

32.СакевичВ. И. Однополыебраки: кризиссемьиилипуть к равноправию? // Демоскоп weekly. 5–18.12.2005. № 225–226.

33.СафароваГ. Л.СтарениенаселенияСанкт-Петербурга: современное состояние и среднесрочные прогнозы // Успехи геронтол. 2002. Т. 10. С. 18–28.

34.Стратегическая психология глобализации: психология человеческого капитала / Под ред. А. И. Юрьева. СПб.: Logos,

2006.

35.Филлипс Ч. Т. Феминизм и семья (историко-социо-

логический анализ). М.: Грааль, 2002.

36.Форд Г. Моя жизнь, мои достижения. М.: Финансы и статистика, 1989.

37.Хлебников П. Ю. Разговор с варваром. М.: Детектив пресс, 2004.

38.Чернышев В. Н., Сависько А. А., Петренко Л. И.,

Куцев С. И. Цитогенетическое исследование детей с пороками развития, рожденных в семьях участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС // В сб.: Здоровье детей и ра-

диация: актуальные проблемы и решения. М., 2001. С. 175– 177.

39.Юрьев В. К., Заславский Д. В., Никифоров Б. Н.

Инфекции, передающиеся преимущественно половым путем, в Ленинградской области: прошлое, настоящее, будущее.

СПб., 2008.

40.Abitbol M. M. The shapes of the female pelvis. Contributing factors // J. Reprod. Med. 1996. Vol. 41. № 4. P. 242–250.

41.Adeoya-Osiguwa S. A., Markoulaki S., Pocock V. et al.

Effect of estradiol 17b and environmental estrogens on mammalian sperm function // Hum. Reprod. 2003. Vol. 18. № 1. P. 100–107.

42.Ang E. S. B. C., Gluncic V., Duque A. et al. Prenatal exposure to ultrasound waves impacts neuronal migration in mace // PNAS 2006. Vol. 103. № 34. P. 12903–12910.

43.Bennet P. H., Burch T. A., Miller M. Diabetes mellitus in American (Pima) Indians // Lancet. 1971. Jul 17. № 2 (7716). P. 125–128.

44.Botting B., Dunnell K. Trends in fertility and contraception in the last quartet of the 20th century // Natl. Stat. Popul. Trends. 2000. Vol. 100. № 1. P. 32–39.

45.Branca F. The challenge of obesity in the WHO European Region and the strategies for response. Copenhagen: WHO Regional Office for Europe, 2007. P. 152–173.

46.Campbell J. D., Elford R. W., Brant R. F. Case-control study of prenatal ultrasonography exposure in children with delayed speech // Cann. Med. Assoc. 1993. Vol. 149. P. 1435–1440.

47.Carlson H. E., Wasser H. L., Reidelberger R. D. Beerinduced prolactin secretion: a clinical and laboratory study of the role of salsolinol // J. clin. Endocr. Metab. 1985. Vol. 60. № 4. P. 673–677.

48.Church C. C., Miller M. W. Quantification of risk from fetal exposure to diagnostic ultrasound // Prog. Biophys. Mol. Biol.

2007. Vol. 93. № 1–3. P. 331–353.

49.Ermakova I. Influence of genetically modified soya on the birth-weight and survival of rat pups: Proc. «Epigenetics, transgenic plants and risk assessment». Freiburg, 2006. P. 41–48.

50.ESHRE Capri Workshop Group. Fertility and aging //

Human. Reprod. Update. 2005. Vol. 11. № 3. P. 261–276.

51.Fatemi M., Ogburn P. L. Jr., Greenleaf J. F. Fetal stimulation by pulsed diagnostic ultrasound // J. Ultrasound. Med. 2001. Vol. 20. № 8. P. 883–889.

52.Goddard M. R., Godfrau H. C. J., Burt A. Sex increases the efficacy of natural selection in experimental yeast populations // Nature. 2005. Vol. 434. № 7033. P. 636–640.

53.Harris M. I., Flegal K. M., Cowie C. C. et al. Prevalence of diabetes, impaired fasting glucose, and impaired glucose tolerance in U.S. adults. The Third National Health and Nutrition Examination Survey1988–1994 // Diabetes Care. 1998. Vol. 21. № 4. P. 518– 524.

54.Joffe M. Are problems with male reproductive health caused by endocrine disruption? // Occup. Environ. Med. 2001. Vol. 58. № 2. P. 281–288.

55.Karasek M., Woldanska-Okonska M. Electromagnetic

fields and human endocrine system // Scientific Wld J. 2004. Vol. 20. № 4. Suppl 2. P. 23–28.

56.Kieler H., Cnattingius S., Haglund B. et al. Sinistrality — a side-effect of prenatal sonography: a comparative study of young men // Epidemiology. 2001. Vol. 12. № 6. P. 618–623.

57.Mariani S. M. Spongiform encephalopathies: a tale of cannibals, cattle, and prions // Med. Gen. Med. 2003. Vol. 5. № 3.

P. 42–51.

58.McLachlan J. A. Environmental signaling: what embryos and evolution teach us about endocrine disrupting chemicals // End. Rev. 2001. Vol. 22. № 3. P. 319–341.

59.Moynihan C. Theories of masculinity // BMJ. 1998. Vol. 317. P. 1072–1075.

60.Moynihan R., Doran E., Henry D. Disease mongering is now part of the global health debate // PLoS Med. 2008. Vol. 5.

№ 5. P. 684–686.

61.Neel J. V. Diabetes mellitus: «a thrifty» genotype rendered detrimental by «progress»? // Amer. J. Hum. Genet. 1962. Vol. 14. P. 353–362.

62.Odent M. Primal Health. London: Century Hutchinson,

1986.

63.Oeppen J., Vaupel J. W. Broken limits to life expectancy //

Science. 2002. Vol. 296. P. 1029–1031.

64.Olshansky S. J., Passaro D. J., Hershow R. C. et al. A potential decline in life expectancy in the United States in the 21 century // New Engl. J. Med. 2005. Vol. 352. № 11. P. 1138–1145.

65.Prusiner S. B. Prions // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1998.

Vol. 95. P. 13363–13383.

66.Reaven G. M. Hypotesis: muscle insulin resistance is the («not-so») thrifty genotype // Diabetologia. 1998. Vol. 41. № 4.

P. 482–484.

67.Relman A. S. Medical professionalism in a commercialized health care market // J.A.M.A. 2007. Vol. 298. P. 2668–2670.

68.Schubbert R., Hohlweg U., Renz D., Doerfler W. On the fate of orally ingested foreign DNA in mice: chromosomal association and placental transmission to the fetus // Mol. Gen. Genet.

1998. Vol. 259. № 6. P. 569–576.

69.Smith J. M. Genetic Roulette: The documented health risks of genetically engineered foods. Yes! Books, Fairfield, IA, 2007.

70.Swan S. H., Elkin E. P., Fenster L. The question of declining sperm density revisited: an analysis of 101 studies published

1934–1996 // Environmental Health Perspectives. 2000. Vol. 108.

№10. P. 961–966.

71.Tinker A. The social implications of an aging population // Mech. Aging Dev. 2002. Vol. 123. № 7. P. 729–735.

72.Van Dieren S., Beulens J. W., Van der Schouw Y. T. et al.

The global burden of diabetes and its complications: an emerging pandemic // Europ. J. Cardiovasc. Prev. Rehabil. 2010. Vol. 17 (Suppl. 1). P. S3–8.

73.Verschaeve L. Genetic damage in subjects exposed to radiofrequency radiation // Mutat. Res. 2009. Vol. 681. № 2–3. P. 259–270.

74.Wolstenolme J., Angell R. R. Maternal age and trisomy — a unifying mechanism of formation // Chromosoma. 2001. Vol. 110.

№2. P. 130–135.

75.Yang Q., Sherman S. L., Hassold T. J. et al. Risk factors for trisomy 21: maternal cigarette smoking and oral contraceptive use in a population-based case-control study // Genet. Med. 1999. Vol. 1. № 3. P. 80–88.

У ветвистоусого рачка Moina macrocopa естественная смерть наступает до утраты способности размножаться. Следовательно, у животных, наряду с продлевающим жизнь механизмом витаукта, существует механизм, сокращающий ее продолжительность.

Ключевые слова: беспозвоночные, сокращение продолжительности жизни, витаукт, Moina macrocopa

Изучение коротких онтогенезов позволяет понять, как шло становление в ходе эволюции онтогенезов продолжительных. Жизнь моин

Moina macrocopa (Cladocera, Crustacea) коротка. Продолжительность ее у разных географических рас этого вида — 5–9 дней [3]. M. micrura живет еще меньше — около 4 дней [8]. Оба эти виды — обитатели луж. Их яйца лежат сухими на земле. Вылупляются из них рачки после дождя и быстро достигают большой численности. Предки моин жили в непересыхающих водоемах. Укоротился ли у них онтогенез после вселения в водоемы, существующие недолго? Для ответа на этот вопрос представляло интерес выяснить, имеется ли у моин старческий период, то есть период, во время кото-

Продольный срез через свежий трупик Moina macrocopa:

Я — яичник; ПЗ — завершающие развитие зародыши, находящиеся в выводковой сумке; П — «плацента», выделявшая в выводковую сумку питательные вещества для нужд зародышей; Г — голова; Н — ноги

рого способность производить потомство утрачена. О его наличии или отсутствии можно судить по состоянию гонад у умирающих естественной смертью особей. Поэтому целью работы было гистологическое обследование таких особей M. macrocopa.

Поскольку онтогенез моин короткий, а встречаются они обычно в большом количестве, естественная смерть в их популяциях — явление частое. Чтобы его наблюдать, нужно осторожно подвести под их рой банку так, чтобы он с водой в нее перетек. Моины в банке вскоре успокаиваются и продолжают, как и в луже, плавать у поверхности воды. У состарившихся же особей биения плавательных антенн прекращаются, и они опускаются на дно. За 2–3 ч на дне трехлитровой банки накапливается с десяток умирающих естественной смертью рачков и их трупиков. Их фиксировали в жидкости Буэна. Толщина парафиновых срезов была 7 мкм, окраска — гематоксилином по Гейденгайну. Было обследовано 90 рачков из луж и 55 — из аквариумов.

Cтарческого периода в онтогенезе моины не оказалось. У большинства обследованных особей в яичниках были яйцеклетки, а в выводковой сумке — завершающие развитие зародыши (рисунок). Смерть наступала обычно перед линькой — этапом в жизни особи, когда ее способность противостоять повреждениям ослаблена. На отсутствие старческого периода в онтогенезе моины указывал также В. И. Разлуцкий [4]. Этого периода нет и у многих других беспозвоночных [6, 7, 9]. У них и у моины в ходе естественного отбора, вероятно, закрепились мутации, снижающие на определенном этапе онтогенеза надежность работы какой-то жизненно важной системы организма. Витаукт же, вероятно [5], — наоборот, результат возникновения мутаций, увеличивающих надежность работы систем организма.

Существование видов, естественная смерть которых происходит до исчерпания способности размножаться, дает основание рассматривать витаукт

как частный случай регуляции продолжительности жизни. Вероятно, в основе процесса естественного окончания онтогенеза животных и человека лежит исходный механизм старения. Он делает смерть особи неизбежной. Его работа может быть под влиянием отбора в связи с экологической необходимостью в той или иной мере замедлена витауктом или, как это происходит у беспозвоночных, ускорена. Можно предположить и существование видов, у которых исходный механизм старения естественным отбором не изменен. Исходный механизм старения, вероятно, и есть тот первичный механизм старения, на необходимость выявления которого указывает В. Н. Анисимов [1, 2].

Литература

1. Анисимов В. Н. Эволюция концепций в геронтологии: достижения и перспективы // Успехи геронтол. 1999. Вып. 3.

С. 32–53.

2.Анисимов В. Н. Молекулярные и физиологические ме-

ханизмы старения. СПб.: Наука, 2003.

3.Галеева Т. И., Попов Е. П. Сравнительная оценка ре-

продуктивных свойств экотипов Moina macrocopa Straus //

Всб.: Совершенствование методов разведения и селекции рыб на теплых водах. Л.: ГНИИ озерного и речного рыбного хозяйства, 1982. Вып. 187. С. 209–218.

4.Разлуцкий В. И. Влияние трофических условий на скорость биологических процессов у Moina macrocopa Straus и M. rectirostris Leydig // Гидробиол. журн. 1992. Т. 28. № 7. С. 53–59.

5.Фролькис В. В. Старение. Нейрогуморальные механиз-

мы. Киев: Наукова думка, 1981.

6.Chadwick N. T., Furman I. L., Weisman D. Life history and senescence of Botryllus schlosseri (Chordata, Ascidiacea) in Monterey Bay // Biol. Bull. 1995. Vol. 169. P. 36–41.

7.Collatz K.-G. Towards a comparative biology of aging // In: Insect aging. Strategies and mechanisms. Berlin: Springer Verlag, 1986. P. 1–8.

8.Lynch M. The evolution of cladoceran life histories // Quart. Rev. Biol. 1980. Vol. 55. № 1. P. 23–42.

9.Rueppel O., Christine S., Mulcrone C. Aging without functional senescence in honey bee workers // Curr. Biol. 2007. Vol. 17.

№ 8. P. R274–R275.

Исследована характеристика эпигенотипов клеток Dunaliella viridis Teod. в процессе хронологического и репликативного старения. Показано, что к 40-м суткам накопительного культивирования, что совпадало со стационарной фазой роста, в клетках Dunaliella viridis увеличивалось содержание ДНК в два раза, триацилглицеридов — в три раза, а β-каротина — в два раза, доля карбонилированных белков увеличивалась в два раза, содержание РНК уменьшалось по сравнению с клетками, находящимися в экспоненциальной фазе роста, то есть к 40-м суткам роста культуры формируется возрастзависимый эпигенотип. Получено четыре субкультуры, которые пересаживали на протяжении двух лет в середине логарифмической фазы роста (суб- культура-10), в начале стационарной фазы роста (суб- культура-20), в середине стационарной фазы роста (субкультура-30) и в конце стационарной фазы роста (субкультура-40). Показано, что эпигенотип субкульту- ры-10 оставался неизменным на протяжении двух лет культивирования, то есть для него не проявлялось репликативное старение. В то же время, субкультура-20, хотя и достаточно долго (не менее 40 пассажей), сохраняла эпигенотип, характерный для молодой культуры, проявляла возрастзависимые изменения. Выраженные возрастзависимые изменения эпигенотипа в процессе пассирования выявляли для субкультуры-30, а субкуль- тура-40 характеризовалась нестабильным эпигенотипом. Показано, что условия культивирования определяют интенсивность репликативного старения у Dunaliella viridis.

Ключевые слова: эпигенотип, старение, культивирование, субкультура Dunaliella viridis Teod.

Все существующие гипотезы старения можно распределить на три группы — генетическая, средовая и интегральная.

Вгенетическую группу гипотез можно включить работы, утверждающие наличие биологических часов или программ старения (гены старения, апоптоз, теломеразная гипотеза, феноптоз и др.) [32, 38].

Всредовую группу гипотез необходимо включить работы о ведущей роли факторов среды (питание, температура, радиация и др.) в процессах старения. Исходя из этого, можно полагать, что, создавая «оптимальные» условия для функционирования организма, можно «отменить» или су-

щественно замедлить процессы старения. Авторы этих представлений исходят из потенциального бессмертия организмов, способных к авторегуляции и адаптации [15].

В группу интегральных представлений о механизмах старения можно включить гипотезы, объясняющие интегральные взаимодействия факторов среды с геномом, результатом которого является старение организма, что может быть интерпретировано как эпигенетические механизмы старения [7, 18].

Совершенно очевидно, что экспериментальные подтверждения существующих представлений о механизмах старения — задача чрезвычайно сложная. Это связано с тем, что биологические системы, являясь открытыми, адаптивными и высокодинамичными, характеризуются неопределенностью функционирования, которая проявляется в многообразии ответных реакций организма на одни и те же факторы среды. Такая неопределенность объясняется принципом исходного состояния системы и наличием уже сформировавшейся эпигенетической памяти [6]. Более того, неопределенность функционирования биологических систем существует и в самом понятии «оптимальных» условий функционирования организма. Не ясно, должны ли эти оптимальные условия изменяться в течение суток, года, в процессе онтогенеза и т. д. Вместе с тем, решение этой проблемы является определяющим в развитии методологии современных геронтологических исследований.

Один из подходов решения этой проблемы может быть основан на использовании достаточно простых, адекватных экспериментальных моделей, в частности клеточных культур, для которых легче создать условия «оптимального» функционирования. Мы отдаем себе отчет в том, что результаты, полученные на таких моделях, не всегда могут быть экстраполированы на целый организм. Тем не ме-

нее, использование таких моделей имеет и самостоятельный интерес, так как их можно применять в современных биотехнологиях.

Исследование механизмов старения клеточных культур началось с пионерских работ A. Carrel [19], однако формирование цитогеронтологии как научного направления началось после публикации работ L. Hayflick [24]. В настоящее время на культурах растительных и даже бактериальных клеток показано, что при длительном культивировании происходят необратимые метаболические изменения, которые ингибируют репликативные процессы, сходные с онтогенетическим снижением пролиферативного потенциала в клетках млекопитающих [21, 31].

Многочисленные исследования механизмов клеточного старения позволили сформулировать две концепции старения клеток в культуре: хронологическое старение — старение клеток в пределах одного пассажа [20] и репликативное старение — старение клеток в процессе длительных пересадок [25].

Как известно, клетки млекопитающих, переведенные в систему in vitro, адаптируясь к новым условиям, могут существенно изменять свои свойства. Вследствие нестабильности генома в системе in vitro может происходить трансформация, и клетки способны приобретать иммортальность [26]. Эти особенности поведения клеток млекопитающих в культуре вызывают обоснованный скептицизм в отношении корректности интерпретации этих результатов с позиции старения клеток.

Альтернативой клеточным культурам млекопитающих могут служить культуры природно живущих одноклеточных организмов, в частности микроводорослей рода Dunaliella viridis. Эти микроводоросли являются свободноживущими подвижными эукариотическими клетками. У них нет клеточной стенки, как у растительных объектов, их клетки окружены плазмалеммой, как у клеток животных. Автотрофный способ питания этих микроводорослей позволяет исключить влияние комплекса трофических факторов на механизмы старения. Они легко культивируются и являются объектом современных биотехнологий, так что управление процессами «старения» в данном случае представляет и большой практический интерес.

Исходя из этого, культура Dunaliella может быть использована для проверки гипотезы влияния средовых факторов на процессы старения. В работе экспериментально проверяли гипотезу, согласно которой созданием «оптимальных» условий для

функционирования в случае вегетативного размножения клеток можно «отменить» репликативное старение. Известно, что этот вид водорослей способен как к вегетативному, так и к половому размножению, но последнее происходит только в экстремальных для данной культуры условиях.

В качестве показателей репликативного старения культуры использовали степень плоидности клеток, которую оценивали по содержанию ДНК, триацилглицеридов, β-каротина, карбонилированных белков, а также по содержанию РНК и белков в процессе длительного культивирования разных субкультур Dunaliella viridis.

Материалы и методы

В экспериментах использовали культуру одноклеточной микроводоросли Dunaliella viridis Teod. var. viridis f. euchlora, штамм IBASU-A N 29 (из коллекции культур водорослей Института ботаники НАН Украины, Киев).

Условия культивирования

Микроводоросли культивировали на жидкой среде Артари в модификации Н. П. Масюк [14] в плоскодонных конических колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем культуры — 20 мл, начальная концентрация клеток — 1,3 млн/мл) при

Рис. 1. Концентрация клеток маточной культуры D. viridis в стандартных условиях культивирования (здесь и на рис. 2: освещенность 4 кл, температура 26–28 °С, исходная концентрация клеток

1,3 млн кл/мл, культуру пересаживали на 21–22-е сутки роста)

постоянной температуре 26–28 оС и круглосуточном освещении (4 клк).

Для получения различных субкультур клетки микроводорослей пересаживали на свежую среду Артари:

–каждые 10 дней, середина экспоненциальной фазы, субкультура-10;

–каждые 20 дней, выход в стационарную фазу, субкультура-20;

–каждые 30 и 40 дней (ранняя и поздняя стадии стационарной фазы, субкультуры-30 и -40, соответственно), рис. 1.

Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Концентрацию клеток выражали в млн кл/мл.

Определение содержания общих липидов и β-каротина в клетках микроводорослей

Клетки микроводорослей осаждали центрифугированием (3000 g, 20 мин) и дважды промывали средой Артари. Липиды и пигменты экстрагировали последовательно смесями органических растворителей, как описано ранее [17].

Хлороформные экстракты анализировали методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия) в системе гексан : диэтиловый эфир (4 : 1). Количественное содержание липидов определяли по методу [10]. Фракцию β-каротина элюировали смесью хлороформ : метанол (2 : 1). Экстинкцию элюатов определяли при длине волны 400 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия). Содержание фракций липидов и β-каротина определяли по калибровочным кривым и выражали в мкг/млн клеток.

Определение суммарного содержания нуклеиновых кислот и белка

В осадках после экстракции липидов проводили гидролиз РНК и ДНК, как описано ранее [5]. После гидролиза ДНК и РНК осадки растворяли в 1 Н NaOH и определяли белок по Лоури [30], содержание белка выражали в мкг/млн клеток.

Определение содержания карбонилированных белков

Метод оценки окислительной модификации белков основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-ди- нитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов [12].

Содержание карбонилированных белков определяли в осадках, полученных после экстракции липидов, пигментов и гидролиза ДНК и РНК.

В полученные осадки вносили 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-ДНФГ в 2 Н HCl (опытная проба), в контрольную пробу вносили 0,5 мл 2 Н HCl. Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, периодически встряхивая каждые 10–15 мин. Затем в контрольную и опытную пробы вносили по 0,5 мл 20 % раствора трихлоруксусной кислоты и осаждали белок центрифугированием при 3000 g 15 мин. Полученные осадки трижды промывали 1 мл смеси этанол : этилацетат (1 : 1, v/v) для удаления несвязавшегося 2,4-ДНФГ. После отмывки осадки растворяли в 2 мл 8 М мочевины (рН 2,3 буфер). Спектр поглощения полученных растворов анализировали на двухлучевом спектрофотометре «Specord UV VIS» (Германия), интервал 363–373 нм. Количество карбонилированных белков выражали в нмоль/мг белка, используя коэффициент молярной экстинкции 22•103 М–1 см–1.

Результаты обрабатывали статистически, достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента для малых выборок [13].

Странные аттракторы интенсивности роста микроводорослей построены на временных рядах конечной концентрации клеток четырех различных субкультур методом карт временной задержки с помощью программы Matlab 6.

Результаты и обсуждение

Характеристика разных субкультур Dunaliella viridis

На протяжении всего эксперимента (около двух лет) водоросли культивировали при круглосуточном и постоянном освещении (4 кл), постоянной температуре (26–28 °С), при пересадках культур исходное количество клеток всегда было одинаковым и равнялось 1,3 млн кл/мл, то есть условия соответствовали оптимальным для этого вида водорослей. В таких оптимальных условиях при накопительном культивировании к 20–21-м суткам культура выходила на стационарную фазу роста, которая завершалась к 40–50-м суткам (см. рис. 1), после чего наблюдали достаточно быструю гибель клеток.

Следовательно, 10-е сутки роста соответствуют середине экспоненциальной фазы, а 30-е сутки близки к середине стационарной фазы роста, в то время как 20-е и 40-е сутки роста культуры являются ранней и поздней стадиями стационарной фазы (см. рис. 1). Это — типичная кривая роста

клеток в культуре в случае накопительного или периодического культивирования Dunaliella viridis.

Известно, что прохождение фаз роста культурой регулируется комплексом факторов: истощением питательных компонентов среды; накоплением экзометаболитов клеток; увеличением концентрации клеток, что сопровождается изменением газо- и массопереноса в такой среде. Все это позволяет говорить о наступлении так называемого стационарного старения клеточных культур, то есть о хронологическом старении клеток в культуре [16].

Исходя из этого, можно утверждать, что если мы регулярно будем пересаживать культуру Dunaliella viridis на 10-е сутки роста, то есть в середине экспоненциальной фазы роста, то обеспечим квазинепрерывное культивирование и создадим условия, близкие к «оптимальным», поскольку устраним лимитирующие факторы роста. Соответственно, при таком подходе можно получить «стационарные» культуры разных «возрастов», или субкультуры.

Исходя из этого, нами были получены четыре субкультуры, то есть культуры, которые постоянно пересаживались через каждые 10, 20, 30 и 40 дней роста (соответственно, субкультуры-10, -20,

-30 и -40) при строгом соблюдении стандартных условий культивирования на протяжении двух лет (рис. 2).

К сожалению, единый метаболический критерий старения клеточных культур пока не найден. Пожалуй, наиболее значимыми в этом отношении являются степень полиплоидизации, накопления нейтральных липидов, а для Dunaliella viridis — и β-каротина [4], а также карбонилированных белков как продукта свободнорадикальных процессов [22].

Оказалось, что на 10-м пассаже содержание ДНК в клетках субкультуры-10 и -20 составляло 0,116 и 0,124 мкг/мл клеток, в субкультуре-30 — 0,100, а в субкультуре-40 оно составляло 0,300, что в два раза больше субкультур-10 и -20 (таблица).

Следовательно, увеличение временных интервалов между пересадками культур коррелирует с увеличением плоидности клеток и наиболее выражено в субкультуре-40.

Учитывая, что в используемых нами условиях культивирования клетки Dunaliella viridis размножались вегетативно, можно утверждать, что субкультуры-10 и -20 представлены активно про-

лиферирующими гаплоидными гаметофитами, а субкультуры-30 и -40 представлены диплоидными и полиплоидными клетками.

Как известно, с возрастом может изменяться липидный метаболизм [36], что сопровождается накоплением нейтральных липидов. Оказалось, что содержание триацилглицеридов (ТГ) в суб- культуре-30 было в два раза больше по сравнению с субкультурой-10, а в субкультуре-40 — в 2,5 раза больше, соответственно (см. таблицу).

Содержание ТГ в клетках Dunaliella viridis скачкообразно увеличивалось в субкультуре-30 по сравнению с субкультурой-20 и достигало наибольшей величины в клетках субкультуры-40 (см. таблицу).

В то же время, содержание β-каротина увеличивалось практически линейно от клеток субкуль- туры-10 к субкультуре-40 (см. таблицу), что также указывает на проявление процессов старения в культуре Dunaliella viridis.

Выявленные временные изменения таких показателей, как степень полиплоидизации, содержание ТГ и β-каротина, позволяют заключить, что субкультура-10 может быть принятой в качестве «молодой» культуры, а субкультура-40 — в качестве «старой» культуры. Субкультуры-20 и -30 можно отнести к переходным возрастным состояниям клеточных культур.

ǙǢǟ

30

24

18

ǧȤȜȔȪȜȟȗȟȜȪșȤȜȘȯ 12

ǥǢǟ

6

0

ǟȔȤȢȦȜȡ ǖșȟȢȞ

ǦȧȕȞȧȟȰȦȧȤȔ ǦȧȕȞȧȟȰȦȧȤȔ

ǦȧȕȞȧȟȰȦȧȤȔ ǦȧȕȞȧȟȰȦȧȤȔ

Рис. 3. Характеристика эпигенотипов субкультур-10, -20, -30 и -40 D. viridis, которую оценивали

по содержанию ДНК (мкг/108кл), РНК (мкг/107кл), белка (мкг/106кл), β-каротина (мкг/107кл)

и триацилглицеридов (мкг/107кл) в клетках

Представляло интерес определить содержание РНК и белка в клетках субкультур «разного» возраста. Было обнаружено, что содержание РНК в клетках субкультур-10, -20 было одинаковым и незначительно уменьшалось в клетках субкуль- туры-30 и было в два раза меньше в клетках суб- культуры-40 по сравнению с субкультурой-10 (см. таблицу).

Следовательно, в процессе старения культур Dunaliella viridis наблюдали уменьшение содержания РНК в клетках.

Содержание белка в клетках субкультуры-30 было меньше по сравнению с субкультурой-10 (см. таблицу). Содержание белка в клетках субкульту- ры-40 было выше, чем в других субкультурах, и составляло 8,51 мкг/млн клеток. Это указывает на функциональные изменения клеток субкуль- туры-40 по сравнению с другими субкультурами. Можно заключить, что полученные субкультуры различаются между собой по формирующимся в процессе культивирования эпигенотипам.

Если представить исследуемые показатели в графическом виде в одной системе координат, то можно видеть, что для субкультур-10, -20, -30 и -40 они различны (рис. 3). Необходимо отметить, что эпигенотип клеток субкультуры-10 не отличался от субкультуры-20, в то же время субкультур-30 и, особенно, -40 уже имели иные количественные характеристики в распределении паттерна метаболических показателей (см. рис. 3). Необходимо отметить, что эти четыре субкультуры формировали две группы сходных эпигенотипов; первая группа характерна для субкультур-10, -20 и -30, вторая — для субкультуры-40.

Следовательно, содержание ДНК, ТГ и β-каротина может служить критерием репликативного старения клеток D. viridis в культуре, и временной интервал между сменами среды культивирования влияет на процесс формирования возрастзависимого эпигенотипа.

Влияние длительных пересадок разных субкультур D. viridis на «возрастзависимые» характеристики эпигенотипа

Содержание ДНК в клетках субкультуры-10 в процессе длительного пассирования (77 пассажей на протяжении двух лет) практически не изменялось (рис. 4). После 50-го пассажа наблюдали небольшое увеличение этого показателя, однако при дальнейшем культивировании проявлялась достаточно высокая вариабельность содержания ДНК (см. рис. 4), что не позволяет утверждать о достоверном изменении количества ДНК в клетках