Получение обогащенных фракций гск/пк из костного мозга крыс методом изопикнического центрифугирования на градиентах перкола

В настоящее время для получения ГСК из костного мозга обычно используют метод выделения фракции мононуклеарных клеток с помощью центрифугирования суспензии клеток костного мозга (ККМ) на градиенте плотности (1,076 г/мл), в качестве которого используют смесь фикол-верографин. В Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айт-хожина был разработан метод разделения ККМ мышей на сложном многоступенчатом градиенте перкола, в результате которого получают три фракции с плавучими плотностями 1,08,1,09,1,095 г/мл, каждая из которых содержит до 73% клеток с фенотипом ГСК/ПК CD34+ (см. гл. Н. Н. Беляевав настоящей монографии). Такой высокий процент ГСК/ПК, по нашему мнению, 132

должен обеспечить более эффективную регенерационную активность вводимых клеток. Кроме того, в вышеназванных фракциях отсутствуют клетки со зрелым фенотипом, такие как Т-, В-лимфоциты, а также моноциты/макро­фаги. Этот факт также предполагает более высокую эффективность исполь­зования клеток костного мозга.

Хотя крысы, как и мыши, относятся к семейству грызунов, необходимо было убедиться, что разработанные ранее приемы выделения обогащенных фракций ГСК/ПК из ККМ мышей пригодны для крыс.

Мы провели выделение трех фракций ККМ и оценили их культуральные и функциональные свойства. В частности изучили продукцию данными фракциями супрессорных факторов под действием цитокинов, наличие которых является атрибутом ГСК/ПК. С этой целью суспензию ККМ получали, промывая бедренные и берцовые кости, затем разделяя ККМ на 5-ступенчатом градиенте плотности перкола со следующими плотностями: 1,100; 1,090; 1,076; 1,060; 1,033 г/мл.

Подсчет клеток в каждой фракции показал следующее распределение в процентах (табл. 1).

Таблица 1

Процентное содержание ядерных клеток, неокрашенных трипановым синим в изопикнических фракциях ККМ крыс

Плавучая плотность клеток, г/мл Содержание клеток, %

1,033 2,2

1,060 3,2

1,076 79,5

1,090 10,9

1,1 2,1

дно пробирки 2Д

Как видно из таблицы 1, наибольшее количество клеток содержалось во фракциях 1,076 и 1,090.

Затем фракцию 1,090 отмывали от примеси перкола и ресуспендировали в культуральной среде. Согласно методу фракционирования ГСК мышей эту фракцию разделяли еще раз на дополнительном двухступенчатом градиенте перкола, получая 3 фракции: Фр. 1 — 1,080 г/мл, Фр. 2 — 1,090 г/мл, Фр. 3 — 1,095 г/мл. Эти фракции стимулировали различными индукторами (Фр. 1—Ш-2, гистамином, АФП, Фр. 2 — IL-3, АФП, ФР. 3 — IL-2, АФП) в течение трех часов, а затем культивировали в течение 48 ч в отсутствии индукторов. О супрессорной активности супернатантов судили по способности подавлять рост клеток миеломы PAI в условиях ex vivo. Результаты эксперимента представлены на таблице 2.

Как видно из таблицы 2, в отсутствие индуктора исследуемые изопикни-Ческие фракции практически не секретировали факторы с супрессорной активностью. Альфа-фетопротеин вызывал наибольшую индукцию супрес­сорной активности во всех фракциях. Фр. 1 кроме того индуцировалась IL-2 и

133

Таблица 2 Продукция супрессорных факторов различными культивируемыми фракциями ККМ

крыс

Фракция Индукторы супрессорной активности (ИС, %)

ККМ без АФП IL-2 IL-3 Гистамин

индуктора

Фр. 1 8,6±1,3 41,9±1,0 24,8±1,4 - 24,4±1,6

Фр. 2 5,8±1,5 38,б±0,9 26,4±0,7

Фр. 3 6,0±1,8 43,4±1,2 31,3±1,0

гистамином, Фр. 2 — только IL-3, а Фр. 3—только IL-2. Полученные данные полностью совпадают с результатами исследования супрессорной активности идентичных изопикнических фракций ККМ мышей (см. гл. Н. Н. Беляева в настоящей монографии). Из этого сопоставления следует, что изопикнические фракции ККМ (1,08,1,09,1,095 г/мл) крыс идентичны фракциям ККМ мышей и, следовательно, относятся к CD34⁺ клеткам, поэтому могут быть использованы в качестве источника ГСК/ПК для регенерационной терапии. Далее необходимо было разработать более упрощенную методику выде­ления необходимых фракций из суспензии ККМ, сократив расход дорогостоя­щего перкола, и оптимизировать количество циклов центрифугирования клеток. Для этого суспензию ККМ наслаивали на трехступенчатый градиент перкола со следующими ступеньками: 1,09, 1,076, 1,06 г/мл. В результате выделились три фракции в соответствующих интерфазах и четвертая фракция, содержащая большое количество эритроцитов на дне пробирки. Фракцию 1,09 дополнительно разделяли на двухступенчатом градиенте (1,09 и 1,08) на три фракции, третья из которых занимала положение, соответствующее плотности приблизительно 1,095. Эта фракция была малочисленная и загрязнена эритроцитами, поэтому в дальнейших экспериментах ее отбрасывали. В остав­шихся двух фракциях клетки составляли 33 и 67 % соответственно. Клетки с плавучими плотностями 1,076,1,08 и 1,09 г/мл были использованы для введе­ния в сердечную мышцу.

ОТРАБОТКА РЕЖИМА ВВЕДЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Способ введения ГСК/ПК является существенным моментом успеха проведения клеточной терапии. Поэтому мы провели специальные исследо­вания по отработке способа и режима введения суспензии ГСК/ПК при моделировании ИМ. Были использованы три режима введения клеток в сердце. Клетки вводили в количестве ЗхЮ⁵ в объеме 100 мкл в одну точку рядом с наложенной лигатурой.

1. Введение клеток сразу после окклюзии коронарной артерии.

2. Введение клеток в сердце через 24 ч после окклюзии коронарной артерии с повторной торакотомией и выведением сердца из грудной полости.

3. Введение клеток в сердце через 38—40 ч после окклюзии коронарной артерии с повторной торакотомией и выведением сердца из грудной полости-

134

Кроме того, при первом и третьем режимах вводили культуральную среду в том же объеме, что и суспензию клеток. На таблице 3 представлены данные по летальности в различных группах животных, которым вводили клетки.

Наименьшую летальность (10%) регистрировали при первом режиме введения суспензии ГСК/ПК.

Как видно из таблицы 3, летальность после введения суспензии ГСК/ПК в течение первых двух часов при втором режиме введения составила 55%, в последующие сутки в живых осталось только 11% животных.

Таблица 3 Количество животных, использованных для отработки режима введения 1СК

Режим введения ГСК Общее Количество % от общего

количество выживших числа

_к„_ыс крыс животных

Сразу после окклюзии 40 __-—- —

Через 24 ч 55 _Jj ^п __

Через 38^0 ч 50 __^ ⁵⁰ __

Введение культуральной среды:

сразу после окклюзии 10 °"

через 38—40 ч | 15 | __?! I ⁵³ _

При третьем режиме дозирования после введения суспензии ГСК/ПК летальность составила 20%, а в течение первых суток пало еще 30% животных.

Летальность после введения культуральной среды существенно не отличалась в группах с аналогичным режимом введения ГСК/ПК. Из этого следует, что высокая смертность была связана с травматичностью операции, а не токсическим эффектом ГСК/ПК. Поэтому низкая летальность при первом режиме введения объясняется минимальным травматическим воздействием на животное.

В связи с высокой летальностью при 2-м и 3-м режимах введения клеток мы решили использовать 1-й режим, т. е. введение суспензии ГСК/ПК сразу после перевязки венечной артерии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ВВЕДЕНИЯ ГСК/ПК В СЕРДЕЧНУЮ МЫШЦУ ПРИ ОИМ

Среди оставшихся в живых животных с введением ГСК/ПК после наркоза летальность составила к 21-му дню наблюдения: с введением фракции 1,076 г/мл (1-я группа) - 20%; с введением фракции 1,080 г/мл (2-я группа) -30%; с введением фракции 0,090 г/мл (3-я фракция) — 5 %.

В дальнейшем, животным с ИМ после введения трех фракций СК в двух режимах дозирования на 7-й, 14-й и 21-й дни после окклюзии проводили электрокардиографическое обследование. Исследование проводили у наркотизированных кетамином животных.

Всего получено 53 эхографических рисунка левого желудочка, аорты, меж­желудочковой перегородки и данных о функциональной активности миокарда. У животных был проведен макроскопический анализ и взяты органы для гисто­логического исследования (сердце, печень, селезенка, почки, надпочечники).

135

Гистологический анализ тканей сердца в трех различных группах, проведенный на 21-й день после окклюзии и введения клеток, показал следующие особенности.

1-я группа (фракция 1,076).

Среди кардиомиоцитов определяются скопления сосудов капиллярного типа, заполненных кровью, между которыми разрастается соединительная ткань. Наблюдается разрастание соединительной ткани между мышечными волокнами. В отдельных кардиомиоцитах определяется паренхиматозная дистрофия. В некоторых зонах вокруг сосудов наблюдается избыточное количество соединительной ткани. Прилежащие кардиомиоциты фрагмен-тированы, поперечная исчерченность сохранена. К очагу инфаркта миокарда прилежат кардиомиоциты с сохраненной поперечной исчерченностью. Инфильтрация круглоклеточная, слабо выраженная, представлена в основном фибробластами, располагающимися межмышечно, немного оттесняя волокна кардиомиоцитов. В очаге организовавшегося инфаркта отмечается разрастание грубо-волокнистой соединительной ткани. В прилежащей ткани сердечной мышцы между кардиомиоцитами отмечается образование нежных соедини­тельнотканных волокон, с очаговой воспалительно-клеточной инфильтрацией. Дальше от очага инфаркта вновь образованная соединительная ткань отсутствует.

2-я группа (фракция 1,080 г/мл).

На срезах наблюдается большое количество мелкого и крупного калибра сосудов, заполненных кровью, фокусы слабо выраженного межмышечного отека, кардиомиоциты сохраняют поперечную исчерченность, ядра четкие. Цитоплазма на отдельных участках имеет разную оптическую плотность. Очаговое разрастание соединительной ткани слабо выраженное. Отличаются выраженный полиморфизм мезотелиальных клеток висцерального листка эпикарда, большое количество тонкостенных сосудов капиллярного типа. В прилежащей ткани наблюдается слабо выраженный отек. Под эпикардом отмечаются очаги разволокнения сердечной ткани. Умеренно выраженная инфильтрация представлена круглоклеточными элементами с примесью полиморфно-ядерных лейкоцитов. На отдельных препаратах встречаются фо­кусы с деформированными кардиомиоцитами с нечеткими контурами ци-топлазматической мембраны, участками разрастания соединительной ткани и межмышечным отеком. Таким образом, зона инфаркта миокарда представле­на тонкостенными сосудами и умеренно выраженной воспалительной кругло-клеточной инфильтрацией с примесью полиморфноядерных лейкоцитов. 3-я группа (фракция 1,090 г/мл).

У животных из данной группы регистрируется инфаркт субэндокар-диальный в стадии организации. Клеточная инфильтрация представлена круглоклеточными элементами. В прилежащих кардиомиоцитах отмечаются изменения соотношения ядерного цитоплазматического индекса в сторону ядра. Стенки коронарных сосудов с умеренным разволокнением заполнены склеенными эритроцитами. Наблюдается умеренно выраженный мышечный отек с примесью фиброцитов и с формированием нежных соединительно­тканных волокон, очаговые межмышечные кровоизлияния, полнокровие

136

сосудов. Поперечная исчерченность кардиомиоцитов сохранена. Большинство сосудов паретически расширены, заполнены склеенными эритроцитами (микротромбы). Таким образом, при исследовании миокарда после введения фракции 1,09 отмечаются изменения сердечной мышцы, характерные для более позднего срока инфаркта миокарда (20—25 дней), по сравнению с аналогичным сроком у инфарктных животных. Основным морфологическим критерием является грануляционная ткань, представленная преимущественно сосудами капиллярного типа с полнокровием, разрастанием оформленной соедини­тельной ткани.

Таким образом, развитие острого инфаркта миокарда, вызванного окклюзией коронарной артерии, укладывается в классические сроки, описанные в литературе и совпадает с клиническими данными. Гистологически выявляется усиленное образование сосудов (ангиогенез) в группе животных с введением суспензии ГСК/ПК фракций 1,076 и 1,090.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований отработан метод выделения фракций клеток костного мозга крыс, обогащенных КСК/ПК. Этот метод включает разделение клеток костного мозга с помощью изопикнического центрифугирования на сложных градиентах перкола.

Испытано несколько экспериментальных моделей острого инфаркта миокарда и детально отработана технология получения инфаркта миокарда в эксперименте на крысах путем перевязки левой венечной артерии. Модель инфаркта характеризовалась развитием гистологической картины, характер­ной для данного заболевания у человека.

Отработан способ введения суспензии КСК/ПК в сердечную мышцу, суть которого заключается во введении Зх 10⁵ клеток в объеме 100 мкл в одну точку в районе перевязки артерии сразу после процедуры наложения лигатуры. Такой способ введения позволил снизить летальность животных от процедуры операции до минимума (11%).

Проведены исследования влияния введения трех фракций КСК/ПК с плавучими плотностями 1,076,1,080 и 1,090 г/мл в сердечную мышцу во время моделирования острого инфаркта миокарда на функциональные и гисто-морфологические показатели сердца подопытных животных. Установлено, что наиболее низкая летальность к 21-му дню после инфаркта наблюдалась при введении фракции 1,090 (5%), а наиболее высокая — при введении фракции 1,080 (30%). Летальность животных при введении фракции 1,076 составила 20%.

Гистологическая картина зоны инфаркта во всех трех группах животных к 21-му дню существенно не различалась. Однако в группах 1 и 3 отмечалась интенсивная васкуляризация капиллярного типа, т. е. появление новых эндотелиоцитов, причем в 1-й группе в большей степени, чем в 3-й.

Список литературы

1. Липовецкий Б.М. Инфаркт, инсульт, внезапная смерть. СПб., 1997. 191 с.

2. Люсов В.А. Инфаркт миокарда (вчера, сегодня, завтра)// Российский кардиологический журнал. 1999. №1. С. 6—15.

137

3. Международное руководство по инфаркту миокарда/Под ред. Р.В.Ф. Кэмпбелл_а М.: Медицина. 1997. 87 с.

4. PhibbsB. The human heart. New York: P.Press, 1997. P. 272.

5. Чазов Е.И. Роль нарушений регуляторных механизмов в формировании заболеваний сердечно-сосудистой системы // Тер.архив. 1999. № 9. С. 8—12.

6. Акмаев И.Г. Взаимодействие основных регулирующих систем (нервной эндокринной, иммунной) и клиническая манифестация их нарушений // Клин.мед. 1997. № 11. С. 8-10.

7. Скворцов А.А., Пожарская НИ. Роль нейрогормональных систем в патогенезе хронической сердечной недостаточности // Росс.мед.журн. 1999. № 2. С. 56—61.

8. Комаров Ф.И., ОльбинскаяЛ.И.,Литвщкий П.Ф. и др. Коррекция экстракардиаль-ных влияний на сердце как метод лечения ишемической болезни сердца // Фармакология и токсикология. 1982. № 3. С. 53—59.

9. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984. 272 с.

10. Литвицкш П.Ф., Сандриков В.А., Демуров ЕЛ. и др. Адаптивные и патогенные эффекты реперфузии и реоксигенации миокарда. М.: Медицина, 1994. 280 с.

11. Комаров Ф.И., Олъбтская Л.И., Литвщкий П. Ф. и др. Коррекция экстракардиаль-ных влияний на сердце как метод лечения ишемической болезни сердца // Фармакология и токсикология. 1982. № 3. С. 53—59.

12. Олъбинская Л. И., Литвщкий П. Ф. Коронарная и миокардиальная недостаточность. М.: Медицина, 1986. 272 с.

13. Крыжановский Г.Н. Патология регуляторных механизмов // Пат.физиол. и эксперим.терапия. 1990. № 2. С. 3—8.

14. Maseri A., Chierchia S., Davies G. Pathaphysiology of coronary occlusion in acute infarction //Circulation. 1986. Vol. 73. N 2. P. 233-239.

15. OpieL.H. The Heart: Physiology, Metabolism, Pharmacology and Therapy. London: Arune and Stratton, 1984. 391 p.

16. Виноградов А.В., Дмитриев Г.П., Арутюнов Г.П. и др. Определение массы и скорости образования инфаркта миокарда в реальном масштабе времени // Кардиология. 1988. № 4. С. 24-26.

17. Ross A.M., Coyne K.S., Moreyra E. et al., for the GUSTO-1 Angiographic Investiga­tors. Extendee mortality benefit of early postinfarction reperfusion//Circulation. 1998. P. 1549-1556.

18. Руда М.Я. Базовое лечение больных острым инфарктом миокарда // Росс.мед.журн. 1999. № 6. С. 3—8.

19. Gavagan Т., ReddyMJ. Myocardial Infarction: The First 24 hours //Pharma J. 1997-2"" edition. P. 16—23.

20. Сумароков А.В., Моисеев B.C. Клиническая кардиология. М.: Универсум Паблишинг, 1996. 248 с.

21. Шевченко Н.М. Рациональная кардиология. М.: Стар'Ко, 1997. С. 256.

22. Фармакотерапия сердечно-сосудистых заболеваний / Под ред. Е.И.Чазова. М-Медицина, 2000. 416 с.

23. Явелов И.С. Современные подходы к раннему лечению острого инфаркт^ миокарда // Росс.мед.журн. 1997. Т. 6. № 2. С. 72—82.

24. Поминова Н.М. Роль опиоидного тетрапептида в регуляции функциональной активности надпочечников при экспериментальной сердечно-сосудисто» патологии: канд. дисс. Алма-Ата, Томск, 1992. 148 с.

138

25. Сапронов Н.С., ТоркуновПА., ЕлисеевВ.В. и др. Влияние нового фенилалкильного производного таурина на размер зоны некроза при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс // Пат.физиол и эксперим.терапия. 1999. № 4. С. 19—20.

26. Karagueuzian H.S., Mandel W.J. Электрофизиологические механизмы нарушений ритма желудочков: корреляция экспериментальных и клинических данных // В кн.: Аритмии. / Под ред. W.J. Mandel. M.: Медицина, 1996. Т. 2. С. 256—278.

27. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко В.А. Клеточная кардио-миопластика //Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. № 2. С. 1-17.

28. Новиков В.П. Инфаркт миокарда. Патогенез, фармакотерапия, профилактика. М.: Лань, 2000. 336 с.

29. Болл СДж., Кемпбелл Р.В.Ф., Френсис Г.С. Международное руководство по сердечной недостаточности. М., 1995. 90 с.

30. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. Сердечно-сосудистая хирургия. 2001. Болезни и врожденные аномалии системы кровообращения. М.: Изд-во НЦССХ им. Бакулева. 2002. 83 с.

31. Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука, 1982. 288 с.

32. Бродский В.Я. Полиплодия в миокарде: компенсаторный резерв в сердце // Бюлл. экспер. биол.и мед. 1995. Т. 199. № 5. С. 454-^459.

33. Гуриев СБ. Экстрацеллюлярные компоненты сердечной мышцы в процессе повреждения и репарации при экспериментальном инфаркте миокарда: Автореф. дис. 1989. 16 с.

34. Полежаев Л.В. Факторы регенерации нерегенерирующих органов и тканей // Вестн. РАН. 2000. Т. 70. С. 597-603.

35. СаркисовД.С Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1979.284 с.

36. Дыгай A.M., Шахов В.П. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. Томск: ТГУ, 1989. 224 с.

37. Карлов А.В., Шахов В.П. Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики. Томск: STT, 2001. 480 с.

38. Гольдберг ЕД., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: ТГУ, 1992. 264 с.

39. Шахов В.П. Дрейфующий медленноразвивающийся каскадоподобный механизм адаптации при действии на организм экстремальных факторов // Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. 1996. Т. 121. № 5. С. 571—574.

40. Анохин ПК. Очерки по физиологии функциональных систем. М.: Медицина, 1975. 448 с.

41. Маянский Д.Н. Клетки Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск, 1981. 172 с.

52. Меерсон Ф.З. Адаптация, деадаптация и сердечная недостаточность. М.: Медицина, 1977. 344 с.

53. Судаков К.В. Новые аспекты классической концепции стресса // Бюлл. экспер. биол. 1997. Т. 123. № 2. С. 124-128.

54. Makino S., Fukuda К., Mioshi S. et al. Cardiomyocytes can be regeneration from mar­row stromal cells in vitro // J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 697—705.

55. Tomita S., Li R.K., Jia Z.Q. et al. Bone marrow cells transplantated in cardiac scar induced cardiomyogenesis and angiogenesis and improved damaged heart function // Circulation. 1999. Vol. 100 (suppl.l). 1-91-1-92.

139

КОНЦЕПЦИЯ ПО ИЗУЧЕНИЮ И ИСПОЛЬЗОВАНИЮ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ

ВВЕДЕНИЕ

Настоящая концепция разработана в соответствии с посланиями Президента Республики Казахстан народу Казахстана от 1 марта 2006 г. "Стратегия вхождения Казахстана в число пятидесяти наиболее конкурентно-способных стран мира", от 18 февраля 2005 г. "Казахстан на пути ускоренной экономической, социальной и политической модернизации", Государственной программой реформирования и развития здравоохранения Республики Казахстан на 2005—2010 гг., утвержденной Указом Президента Республики Казахстан от 13 сентября 2004 г. № 1438.

Разработка настоящей концепции продиктована необходимостью стратегического видения перспектив развития научных разработок и внедрения в практику клеточной терапии в Республике Казахстан.

1. АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В СОВРЕМЕННОЙ МЕДИЦИНЕ

Последние десятилетия в медицине ознаменовались рядом крупнейших достижений молекулярной и клеточной биологии, на базе которых возникли серьезные научно обоснованные предпосылки для разработки и внедрения в практику принципиально новых и эффективных биотехнологических способов профилактики и лечения многих заболеваний человека. В частности, вопрос идет об использовании метода клеточной терапии, когда живые клетки организма являются не только моделью для изучения, но и становятся эффективным средством лечения заболеваний человека и основная цель клеточной терапии заключается в увеличении биологической функции поврежденных тканей или органов. Исследованию в плане перспективы использования заместительной или восстановительной клеточной терапии с применением стволовых клеток должен быть подвергнут широкий спектр приобретенных и наследственных терапевтических и хирургических заболеваний, а также ряд других острых и хронических синдромов и состояний. Идея клеточной терапии с использованием своих или чужих стволовых клеток для лечения заболеваний человека на сегодняшний день уже стала реальностью-Основой клеточной терапии является клеточная трансплантация. Последнюю можно определить как комплекс медицинских мероприятий, при котором на протяжении короткого или длительного времени организм пациента имеет непосредственный контакт с жизнеспособными клетками ауто-, алло-, изо- или ксеногенного происхождения. Рекомендуемый к клиническому применению метод клеточной терапии провозглашает отказ от медикаментоз­ной коррекции биохимического беспорядка в пораженных клетках. Он нацелей на возмещение в органах отсутствующих клонов специализированных клеток, а также на участие трансплантированных клеток в восстановлении функций

140

сохранившихся клеток пораженного органа. В данном случае акцент ставится на мероприятия, направленные на своевременную замену старых, необратимо измененных клеток новыми путем трансплантации пула донорских клеток или путем стимуляции собственного резерва регенерации, а не на "лечение" старых клеток.

Идея использования клеточных трансплантаций выглядит наиболее выгодной по следующим объективным причинам.

• имеется огромный дефицит качественного донорского материала;

• оказывается невозможным сохранение паренхиматозных органов в условиях низкой температуры (криопрезервация). Поскольку необрати­мое повреждение сосудистого эндотелия во время тепловой и холодовой ишемии, короткие сроки переживания паренхиматозных клеток in situ становятся серьезными барьерами технического порядка, которые, к сожалению, являются непреодолимыми;

• сохраняется высокая себестоимость органных трансплантаций;

• существует опасность развития осложнений, сопутствующих большой хирургии;

• неминуемо развиваются иммунные коллизии, которые приводят к возникновению реакций отторжения трансплантата. Для увеличения сроков приживления трансплантата требуется дополнительное, продолжительное (возможно пожизненное) использование иммуно-супрессивной и иммунодепрессивной терапии;

• отмечается чрезвычайно высокий процент инвалидизации и гибели больных от хронических заболеваний жизненно важных органов.

В то же время пересадка клеток имеет бесспорные преимущества перед органной трансплантацией и обусловлена:

• возможностью повторных эктопических инъекций крио-презерви-рованных клеток, поскольку клетки человека в культуре могут бессрочно храниться в замороженном состоянии и без проблем транспортироваться на длительные расстояния;

• возможностью создания клеточных банков, в которых хранятся бессмертные линии стволовых клеток человека. Они стандартизированы по многим параметрам и могут применяться в лечебных целях;

• наличие клеточных банков и специальных бессмертных линий стволовых клеток человека позволяют врачу уйти от проблем биоэтики и смежных непростых вопросов использования абортного материала в клинике;

• линии специализированных стволовых клеток лишены примеси ретикулоэндотелиальной ткани, которая содержит до 70% антигенов органа и поэтому уровень иммунологических проблем в организме реципиента значительно уменьшен по сравнению с пересадкой исходных органов. Это позволяет отказаться полностью или использовать слабые иммунодепрессивные препараты;

• не последнюю роль играет меньшая себестоимость клеточных трансплантаций по сравнению с пересадкой целого органа;

• метод позволяет обеспечить медицинской помощью большее число больных.

141

Технически метод клеточной терапии в клинике выполняют тремя способами:

1. путем непосредственной трансплантации донорских клеток в строго заданные участки поврежденных органов (например, доставка нейрональных клеток с помощью стереотаксической техники) или доставки клеток в,-соответствующие органы током крови (например, при доставке клеток в| целевой орган током крови);

2. путем дистанционного управления процессами регенерации и пролиферации в поврежденных органах за счет временного размещения донорских клеток в экстракорпоральном контуре перфузионных систем, осуществляющих инкубацию донорских клеток в потоке крове или плазмы больного (например, клеток печени или селезенки);

3. путем регуляции экзогенными цитокинами и другими факторами активности и пролиферации эндогенных стволовых клеток пациента.

Изучение корригирующих возможностей этих технически различающихся методов клеточной терапии позволило установить ряд общих закономерностей реализации их воздействия на организм:

1. стабильность, выраженность и длительность лечебного эффекта при использовании клеточных технологий находятся в прямой зависимости от количества паренхимы, сохранившейся в пораженном органе, которая способна отвечать на регуляторные сигналы;

2. эффективность клеточных трансплантаций зависит от суммарной массы биологической активности используемого донорского материала;

3. выраженность и длительность функционирования пересаженных клеток зависит от биологической (биохимической) адекватности микроокружения. Поскольку физиологически активные вещества, т. е. сигнальные молекулы микроокружения, определяют возможность реализации генетической программы пересаженных клеток.

Широкие возможности применения стволовых клеток для клеточной заместительной и восстановительной терапии были положительно оценены в США, Англии, Германии, Японии, Китае, Корее, Израиле и ряде других стран. В США, несмотря на существующий до последнего времени запрет на государственную поддержку работ согласно инструкции Национального института здоровья (NIH USA) по выделению стволовых клеток из эмбрионов человека, работа с линиями таких клеток разрешена частным лабораториям и биотехнологическим компаниям, включая разработку методов получения линий клеток человека и их терапевтического использования. Среди них такие пионеры клеточных биотехнологий как, Geron Corporation, Stem Cell Inc. и сотни других. Частный бизнес в США вкладывает в биотехнологические компании и исследовательские институты, занятые исследованиями стволовых клеток, миллиарды долларов.

Влиятельная организация пациентов США (Patients Coalition for Urgent Research, USA), играющая определяющую роль в распределении средств на биомедицинские цели, провела скрининг возможного охвата больных, нуждающихся в клинических технологиях, основанных на использований стволовых клеток человека. Анализ показал, что только по следующим

142

основным группам заболеваний: сердечно-сосудистым, онкологическим, аутоиммунным, диабету, заболеваниям с диффузным поражением печени, остеопорозу, болезням Альцгеймера и Паркинсона и другим заболеваниям нервной системы, а также повреждениям позвоночника, порокам развития число потенциальных пациентов может составлять около 128 млн. человек. Этот список может быть пополнен и теми пациентами, которые имеют глубокие ожоги или раны другой этиологии, для лечения которых также необходимы стволовые клетки.

Таким образом, перечисленные возможности применения клеточных трансплантаций достаточно серьезно обосновывают развитие генеральных направлений научных исследований в республике и позволяют сделать важный вывод о том, что они, несомненно, имеют большие перспективы использования в медицине. Дальнейшее развитие фундаментальных исследований механизмов клеточной дифференцировки и регенерации тканей, создание, разработка новых биомедицинских технологий клеточной терапии должно получить государственную поддержку.

Успешное внедрение в практику экспериментальной медицины методов длительного культивирования стволовых клеток и клеток- предшественников различных тканей животных и человека, выделенных из эмбрионов или клонированных из дефинитивных тканей, полученных из различных тканей взрослых организмов, создали предпосылки разработки технологий заместительной клеточной и тканевой терапии.

В настоящее время развитие клеточной трансплантологии идет в следующих главных направлениях: пересадка специализированных соматических клеток и пересадка стволовых клеток (СК).

Трансплантацию соматических клеток сейчас рассматривают в качестве главной альтернативы пересадке органов. С каждым годом количество больных, нуждающихся по жизненным показаниям в трансплантации печени, почек, сердца, растет во всех странах. Это обусловлено заметным демографическим "старением" населения планеты, увеличением количества хронических заболеваний и появлением экологических болезней. Однако пересадка специализированных соматических клеток пока еще не находит в клинике достаточно широкого применения. В первую очередь это связано с ограни­ченными возможностями как самой трансплантации, так и с качеством и количеством донорской ткани.

Огромный прогресс в медицине был достигнут при использовании терапии стволовыми клетками. Стволовые клетки (СК) (по английски stem cell) — это клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в Другие типы клеток. СК характеризуются наличием трех главных свойств:

1. ассиметричностью деления, т. е. вместо образования двух одинаковых Дочерних клеток одна из них способна стать более специализированной, а Другая остается неспециализированной;

2. способностью к самообновлению, т.е. они репопулируют (пролиферация без дифференцировки) на протяжении неопределенно длительного периода Чли даже в течение всей жизни;

3. дифференцировкой в специализированные типы клеток через стадию

143 I

прогениторных клеток (progenitor— "предшественник") из так называемого краткосрочно существующего пула неспециализированных СК.

По происхождению различают 2 группы СК: эмбриональные (ЭСК) ц региональные (РСК).

ЭСК обычно выделяют из эмбриобласта на 5—7-е сутки развития человеческого зародыша. Так, на 2—4 сутки развития зародыша формируются тотипотентные СК, которые являются истинными СК, способными в условиях in situ развиваться до стадии взрослого организма, т. е. стволовые клетки способны дифференцироваться абсолютно во все типы клеток взрослого организма.

Считается, что ЭСК являются универсальными регуляторами обмена веществ. При попадании тем или иным путем ЭСК в какой-либо орган из них всегда образуются только клетки этого органа, что позволяет их использовать в восстановлении поврежденных органов и тканей, для лечения множества тяжелых заболеваний. Они могут способствовать восстановлению утраченных функций (иммунодефициты, наследственные заболевания) и тормозить неконтролируемые патологические процессы (воспаление, аллергии, онкологические процессы), по запросу организма синтезировать биологически активные вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности. Так, в плацентарных и эмбриональных тканях находится большое количество различных регуляторных веществ, таких, как фактор роста фибробластов, фактор роста нервов, фактор, стимулирующий рост макрофагальных и эритроидных колоний, инсулиноподобный и эндотелиотропный факторы роста. Эти вещества являются мощными агентами, влияющими на собственные клет­ки организма реципиента, корректирующими их функциональное состояние и взаимодействие, что во многих случаях способствует восстановлению их нормальной жизнедеятельности.

В ведущих медицинских центрах мира не прекращаются интенсивные научные исследования условий выращивания бессмертных линий ЭСК и их направленной дифференцировки в различные типы соматических клеток. Технологическая возможность осуществления гениндуцированной селекции ЭСК делает их уникальным потенциальным источником сырья для получения промышленных объемов высокоэффективных очищенных стандартизи­рованных клеточных препаратов. Другими словами, ЭСК представляют собой новый мощный биоресурс медицины.

Однако ЭСК официально не используются в клинической медицине, поскольку имеются серьезные препятствия для их применения и они обусловлены:

• во-первых, морально этическими и правовыми проблемами, связанными с прекращением развития человеческих зародышей;

• во-вторых, опасностью перерождения отдельных популяций этих клеток в злокачественные тератокарциномные опухоли после трансплантации их во взрослый организм;

• в третьих, в Казахстане, как впрочем и в России, отсутствует технология создания и длительного хранения эмбриональных стволовых клеток, годных для клинического применения.

144

В случае использования фетальных стволовых клеток, также как и эмбриональных стволовых клеток всплывают серьезные юридические и этические проблемы, поскольку источником их получения является абортивный материал на 18—22 неделе беременности. Кроме того, применение таких клеток чревато развитием осложнений, таких как заражение пациента вирусами, в том числе гепатитом и даже СПИДом, цитомегаловирусом, микоплазмой. Проведение диагностики материала на вирусы и другие инфекции увеличивает себестоимость метода, что в конечном итоге приводит к увеличению стоимости самого лечения.

Безусловно, самым идеальным источником стволовых клеток является плацентарно-пуповинная кровь, собранная после рождения ребенка. Эта кровь относительно богата стволовыми клетками, но общее их количество невелико. Использование пуповинной крови в качестве источника стволовых клеток имеет свои преимущества, во первых, потому, что ее сравнительно легко получить. Во-вторых, что является крайне важным — она идеально подходит ребенку. Получив эту кровь и поместив в криобанк стволовых клеток, в дальнейшем их можно использовать для восстановления практически любых тканей и органов, а также для лечения любых заболеваний, в том числе и онкологических.

Однако действенное применение СК пуповинной крови возможно однократно для самого ребенка до Шлет.

Самым доступным источником РСК, является костный мозг и перифе­рическая кровь человека. Кроме того, ведутся разработки по применению стволовых клеток, полученных из жировой ткани, а также выделенных из слизистой оболочки в районе рецепторов и из других тканей. Наиболее перспективным является использование костного мозга, так как концентрация стволовых клеток в нем самая максимальная. При этом в костном мозге выделяют два вида стволовых клеток: первый — это гематопоэтические стволовые клетки (ГСК), из которых формируются абсолютно все клетки крови, второй—это мезенхимальные стволовые клетки, которые регенерируют практически все органы и ткани. Как правило, используют аспират костного мозга. Другим источником стволовых клеток может являться периферическая кровь. Из периферического кровотока СК можно получить только в том случае, если первоначально их стимулировать к выходу (мобилизация) в периферический кровоток, а затем на специальном оборудовании выделить.

Известно, что с возрастом количество стволовых клеток костного мозга уменьшается. Так, в костном мозге новорожденного на 10 тыс. кроветворных клеток приходится одна стволовая клетка. У подростков стволовых клеток Уже в 10 раз меньше. К 50 годам на полмиллиона обычных клеток приходится лишь одна стволовая, а в возрасте 70 лет всего одна стволовая клетка приходится на миллион кроветворных, соответственно возможности выделения и их использования для регенерации сильно ограничены. При этом весьма остро встает вопрос о специальном оборудовании.

Главными препятствиями на пути внедрения клеточных технологий в Широкую клиническую практику служат два обстоятельства: сохраняющийся Дефицит ауто- и аллогенного донорского клеточного материала с выраженной

145

популяционной активностью и отсутствие убедительных доказательств получения выраженных и пролонгированных клинических эффектов у больных с хроническими и аутоиммунными заболеваниями.

Для решения проблемы нехватки клеточного биоматериала особые надежды возлагаются на расширенное использование ЭСК и РСК. Однако требующиеся высокотехнологические методы получения, сохранения культивирования и стандартизации свойств ЭСК и РСК, а также отсутствие удовлетворительного этико-правового решения проблемы терапевтического клонирования эмбриональных, региональных СК человека во всем мире включая Казахстан, Россию и другие страны, тормозит изучение клинической эффективности применения клеточной терапии. В то же время было бы непростительным для отечественной науки свертывание программ по проведению исследований в этом направлении, тем более, что существующие проблемы входят в разряд разрешимых.

В Республике Казахстан по аналогии с западными странами и Россией назрела серьезная необходимость создания Национальных банков стволовых клеток взрослых, включая стволовые кроветворные клетки, которые можно было по запросу использовать для лечения ряда заболеваний человека.

Для решения такой задачи нужны новые технологии в области культиви­рования СК, полученных из различных источников, основной целью которых должно быть создание оптимальных условий для сохранения морфо-функциональных признаков клеточных трансплантатов, что позволит повысить эффективность клеточной терапии.

Особое внимание следует уделять разработке новых методов или модификации известных методик, направленных на получение стволовых клеток в количестве, достаточном для обеспечения высокой эффективности клеточной терапии. Основу методик должны составлять приемы и подходы, исключающие присутствие в образцах (в том числе в составе сред для культивирования и хранения клеток) токсических компонентов животного или растительного происхождения, а также реагентов, не предназначенных для клинического применения и (или) способных причинить вред здоровью пациента. При разработке методических приемов, направленных на получение конечного продукта клеточной терапии, следует исходить из возможности его использования для лечения как хронических, так и неотложных (острых) состояний и заболеваний. Необходимо установить внутриведомственные стандарты контроля инфекционной, биологической, иммунологической и генетической безопасности полученных стволовых клеток и решить вопросы сертификации препаратов, полученных из стволовых клеток и их дериватов.

Известные случаи клинического применения клеточной терапии в Казах­стане по воле "энтузиастов" в некоторых случаях обгоняют фундаментальные и экспериментальные исследования в этой области, что некоторым образом отрицательно влияет на судьбу всего направления. Именно поэтому разработки в области экспериментального и строгого научного объяснения как вероятных позитивных, так и негативных эффектов клеточной терапии, прежде всего, должны иметь фундаментальный характер. По крайней мере, это поможет решить многочисленные спорные вопросы, связанные не только с обоснова-

146

нием рекомендуемого метода лечения, но и с этической стороной применения различных видов клеточной терапии.

Все мероприятия, начиная с получения материала—источника стволовых клеток до процедуры клеточной терапии, должны проводиться с соблюдением существующих правовых, юридических и этических норм Республики Казахстан, а также других международных нормативных документов и рекомендаций, касающихся этой развивающейся области медицины.

Для биоэтики центральным является принцип "автономии личности пациента, обосновывающий право каждого человека участвовать в качестве самостоятельного субъекта в принятии касающихся лично его жизненно важных медицинских решений. Важнейшее биоэтическое правило добро­вольного информированного согласия призвано на практике обеспечить реализацию принципа автономии личности пациента. Интенсивное развитие исследований биоэтических проблем проведения клинических испытаний на человеке позволило разработать рекомендации, которые предусматривают необходимость контроля независимыми комиссиями или комитетами протоколов таких экспериментов. Ограничено право публикаций их результатов без соответствующей экспертизы первичных материалов в международных журналах. Введены правила GCP (good clinical practice) и GTP (good tissue practice). Результаты изучения биоэтики аккумулированы в Хельсинской декларации всемирной ассоциации врачей (ВМА) 2000 г., международно признанном стандарте проведения научных исследований на человеке. Следующий важный документ—Конвенция Совета Европы (1997) "О защите прав и достоинств человека в связи с применением достижений биологии и медицины". К проблеме трансплантации стволовых клеток прямое отношение имеют все статьи Конвенции. В статье 16 указано, что клеточная терапия с использованием стволовых/прогениторньгх клеток может быть при­менена лишь в случаях, когда традиционные методы хирургического и тера­певтического (альтернативного) лечения не могут гарантировать сохранение жизни или улучшение состояния здоровья пациента, когда риск, которому он подвергается, по меньшей мере, соответствует потенциальной пользе испытания.

Биоэтические комиссии или комитеты входят в состав практически всех международных организаций — ЮНЕСКО, ВОЗ, Совета Европы. Во многих странах создана структурная сеть биоэтических организаций—центральных, региональных и местных (больничных) комитетов по практическому решению вопросов биоэтики. Необходимы они и в Казахстане. На наш взгляд, в клеточной трансплантологии необходимо установить модель взаимоотношения "врач-пациент", которая бы отвечала международным принципам биоэтики.

Однако даже после решения этических, правовых и биотехнологических проблем остается необходимость построения рациональной системы Применения клеточных трансплантаций у больных при разных патологических состояниях. Такая система должна учитывать новейшую информацию о биологии СК и основываться на четких представлениях о механизмах восстановительных процессов с участием СК в поврежденных органах больных. Кроме того, эта система должна строиться с учетом понимания причин

147

угнетения активности собственных РСК и торможения механизмов их естественной дислокации в кровоток и очаги повреждения. Немаловажным обстоятельством является понимание молекулярных механизмов на уровне межклеточных взаимодействий донорских СК с клетками реципиента. В результате, абсолютно незаменимым становится вопрос об определении показаний и противопоказаний к применению различных видов клеточной терапии.