3.4.1. Разработка методов получения, обработки и длительного

ХРАНЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ

ИСТОЧНИКОВ (ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ И ПУПОВИННАЯ КРОВЬ, КОСТНЫЙ

МОЗГ)

Учитывая небольшие объемы крови, которые можно получить из вены пуповинного канатика (в среднем, не более 100 мл), на передний план выступает необходимость заготовки максимального количества крови и снижения риска бактериальной контаминации образцов пуповинной крови. Принципиальным недостатком пуповинной крови можно считать, прежде всего, малое количество гемопоэтических клеток, получаемых при единичной заготовке. Поэтому для последующего использования существует необходимость выделения чистой фракции стволовых клеток из первичного материала как в прикладном, так и в фундаментальном исследовании.

Если для костного мозга потери клеточной массы в процессе сепарации,

171

криоконсервирования, размораживания и тестирования иногда допустимы до 40—50%, то такие потери клеток могут приводить к возникновению несостоятельности трансплантата и рецидива основного заболевания при пересадках. Все это обусловливает необходимость развития эффективных методов получения и хранения клеток пуповинной крови. Однако эти работы требуют большой подготовительной работы как в выборе методик заготовки, сепарации, криоконсервирования пуповинной крови, так и в подготовке персонала, работающего с данным источником стволовых клеток.

Удаление эритроцитов можно проводить с помощью лизирующих растворов, содержащих хлорид аммония. Сохранность ГСК после лизиса эритроцитов достаточно высока, однако данный способ не применяют при банкировании в связи с необходимостью использовать очень большие объемы реагентов. Этот метод оправдан при обработке небольших объемов крови для лабораторных и диагностических исследований.

Для удаления эритроцитов и плазмы образец можно фракционировать методом простого центрифугирования (эффективно при обработке непосредственно после получения) или с помощью градиентов плотности.

Сепарация в градиенте плотности, где в качестве основы используют фиколл (Ficoll-Hypaque) с плотностью d= 1,077 г/мл или перколл (Percoll) с плотностью d=1,069 г/мл, является одним из наиболее распространенных методов сепарации при лабораторных исследованиях. Сохранность ГСК после сепарации в градиенте плотности составляет 92%, а потеря клеток при использовании перколла меньше, чем при использовании фиколла. Использование перколла с плотностью 1,080 г/мл позволяет уменьшить объем пробы пуповинной крови до 10 мл, а содержание ГСК в таком объеме достаточно для проведения трансплантации пациенту с весом менее 10 кг. Использование градиентов плотности растительного происхождения позволяет удалить значительное число эритроцитов, однако при последующей криоконсервации вещества полисахаридной природы могут приводить к осмотическому шоку и гибели ГСК. Важными недостатками данного метода является его длительность (около 2,5 часов) и необходимость использования промежуточных емкостей, прямо контактирующих с биологическим материалом, что повышает вероятность контаминации образца.

Для седиментации и последующего удаления эритроцитов могут быть использованы такие агглютинирующие вещества, как желатин, полиглюкин и гидроксиэтиленкрахмал. Седиментация с помощью 3% раствора желатина позволяет сохранить до 86% ГСК и удалить 96,4% эритроцитов, эта процедура занимает меньше времени, чем сепарация в градиенте плотности: 1,5 ч вместо 2,5. Несмотря на значительный уровень деплеции эритроцитов и высокую сохранность ГСК, серьезной проблемой является способ получения желатина. Желатин—вещество ксеногенного происхождения, которое перед использо­ванием не тестируют на присутствие инфекционных агентов. После криоконсервации желатин очень сложно удалить, поэтому в медицинской практике трансплантаций отказались от его использования для подготовки образцов пуповинной крови к хранению. Полиглюкин также используют для осаждения эритроцитов в образцах пуповинной крови. При оптимальном

172

соотношении полиглюкина и пуповинной крови 1:1 уровень деплеции эритроцитов составляет около 97%. Важно отметить, что после использования полиглюкина нет необходимости проведения отмывок образцов.

Наиболее распространенный метод неавтоматической сепарации пуповинной крови, предложенный Rubinstein et al. в 1995 г., основан на ускорении седиментации эритроцитов при добавлении 6% гидроксиэти-ленкрахмала. После удаления осевших эритроцитов получают надосадок, обогащенный лейкоцитами. Последующее центрифугирование (400 • g, 15 мин) позволяет осадить клетки и удалить плазму, уменьшая объем пробы. Сохранность ГСК при использовании данного метода составляет 87,4%, а его стоимость в 2,2 и 4,1 раза ниже, чем стоимость методов, основанных на применении перколла и фиколла соответственно.

Современным направлением фракционирования пуповинной крови является использование систем фильтров и автоматических сепараторов. Метод с использованием фильтров позволяет выделить 79,5% лимфоцитов, средняя длительность процедуры — 30 мин.

Компактный автоматический клеточный сепаратор Sepax System (Biosafe, Switzerland) используют во многих банках пуповинной крови. Все этапы обработки контролирует микропроцессор. Образцы пуповинной крови помещают в сепарационную камеру, где после центрифугирования получаемые фракции поступают в разные контейнеры, причем лейкоциты поступают непосредственно в контейнер для криоконсервации. Главными преимуществами автоматической сепарации являются ее закрытость и минимальная трудоемкость. Среднее время автоматической сепарации — 15—20 мин, а стандартного центрифугирования—от 60 до 80 мин. Автоматический сепаратор позволяет уменьшить объем образца в среднем на 70%, выделить более 88% лейкоцитов и более 97% CD34⁺ ГСК.

Из-за относительной малочисленности выделяемых стволовых клеток выше приведенными способами существуют значительные трудности их отделения от других клеток. В связи с этим при разработке способов и методов выделения стволовых клеток предпочтение должно отдаваться методикам, обеспечивающим использование наиболее доступного материала для выделения клеток,—это наибольший выход жизнеспособных клеток с высоким запасом пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке; получение воспроизводимых и статистически достоверных результатов; безопасность последующего клинического применения. -

Особое внимание следует уделять разработке новых методов или модификации известных методик, направленных на получение стволовых клеток в количестве, достаточном для обеспечения высокой эффективности клеточной терапии. Основу методик должны составлять приемы, исключаю­щие присутствие в образцах (в т.ч. в составе сред для культивирования и хранения клеток) токсических компонентов животного или растительного происхождения, а также реагентов, не предназначенных для клинического применения и (или) способных причинить вред здоровью пациента. При разработке методических приемов, направленных на получение конечного продукта клеточной терапии, следует исходить из возможности его

173

использования для лечения как хронических, так и неотложных (острых) состояний и заболеваний.

Исследованию в плане перспективы использования заместительной или восстановительной клеточной терапии с применением гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток должен быть подвергнут широкий спектр приобретенных и наследственных терапевтических и хирургических заболеваний, а также ряд других острых и хронических синдромов и состояний.

3.4.2. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ДЛИТЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ EX VIVO

Как было выше сказано, что при выделении гемопоэтических СК из первичного материала их количество совершенно недостаточно для проведения эффективной клеточной терапии взрослому человеку. Следовательно, необходимо проводить размножение СК в условиях in vitro. Такие технологии в настоящее время разрабатываются в различных странах мира.

Вклад стволовых клеток в ранние фазы гематопоэтической трансплантации противоречив, также как и вопрос о числе стволовых клеток, необходимых для успешной длительной трансплантации у человека. Существует большое количество данных для мышей, но степень обоснованности их переноса на человека дискуссионна. Другие варьирующие показатели, касающиеся стволовых клеток, включают их эффективность в хоуминге в костный мозг, их предыдущая пролиферативная история, влияющая на длину теломеров и их способность усиливать активность теломеразы. Степень увеличения числа стволовых клеток in vivo после трансплантации или ex vivo после стимуляции цитокинами обсуждается и поднят вопрос о внешних воздействиях на клетки для изменения вероятности самообновления стволовых клеток.

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) образуют все клетки крови и иммунные клетки и используются в клинических протоколах по трансплан­тации для лечения разнообразных заболеваний. Способность увеличивать число ГСК vivo или in vitro обеспечит новые возможности для лечения, но амплификации ГСК было трудно достигнуть. Понимание механизмов само­обновления ГСК сделало амплификацию ГСК важной клинической целью.

Микроокружение костного мозга представляет собой сложную трехмер­ную структуру, где гематопоэтические клетки пролиферируют, приобретают зрелость, мигрируют в синусоидальное пространство и выходят в циркуляцию регулируемым образом. Стромальные клетки в микроокружении костного мозга обеспечивают подходящее окружение для самообновления, пролифе­рации и дифференцировки гематопоэтических клеток. Внутри гематопоэти-ческого микроокружения существует эмбриональный желточный мешок, зародышевая печень или взрослый костный мозг. Микроваскулярный эндотелий не только действует, как сторож ворот, контролирующий траффик и хоуминг гематопоэтических прогениторов, но также обеспечивает клеточный контакт и секретирует цитокины, которые разрешают сохранение устойчивого состояния гематопоэза. В последнее время гомогенные слои эндотелиальных клеток костного мозга были изолированы и культивировались в условиях клеточной культуры. Длительные культуральные исследования показали, что

174

монослой эндотелиальных клеток костного мозга является уникальным типом эндотелия и может поддерживать длительную пролиферацию гематопоэти­ческих прогениторных клеток, в особенности мегакариоцитов и миелоидных прогениторных клеток путем выработки линия-специфичных цитокинов, таких, как G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Kit-лиганд, IL6, FLK-2 лиганд и ингибиторный фактор лейкемии. Прямые клеточные контакты между гематопоэтическими прогенаторными клетками и эндотелиальными клетками костного мозга через специфические молекулы адгезии, включающие бета-1, бета-2 интегрины и селектины играют критическую роль в траффике и возможно пролиферации гематопоэтических стволовых клеток. Дисфункции микрососудистых эндотелиальных клеток в гематопоэтическом микроокру­жении могут приводить к расстройствам функции стволовых клеток и прогрес-сировании пластических анемий, а также вносят вклад в нарушения прижив­ления трансплантанта при трансплантации костного мозга. Дальнейшее изуче­ние роли микроваскулярного эндотелия в регуляции хоуминга гематопоэти­ческих клеток может увеличить наше знание о патофизиологии стволовых клеток и лейкемии.

Интерлейкин-3 является мультипотентным фактором роста, продуцируе­мым активированными Т-клетками, моноцитами/макрофагами и стромальны-ми клетками. Человеческий ген IL-3 локализуется на хромосоме 5 около сегмента 5q31. Рецептор высокой аффинности для человеческого IL-3 состоит из альфа и бета субъединиц. IL-3 делит общую бета субъединицу с гранулоцит-макрофаг колние-стимулирующим фактором (GM-CSF) и IL-5; эта субъединица картируется на хромосоме 22ql3.1. Биологические эффекты IL-3 изучались на человеческих и мышиных линиях гематопоэтических клеток и нормальных клетках человеческого костного мозга. Добавление IL-3 к культуральной среде индуцирует пролиферацию, созревание и, возможно, самообновление плюрипотентных гематопоэтических стволовых клеток и клеток миелоидной, эритроидной и мегакариотической линий. Человеческий IL-3 был клонирован в 1986 г., и с этого времени различные клинические исследования подтвердили in vivo потенциал рекомбинантного человеческого (rhIL-З). Первоначальные результаты исследования фазы 1Д1IL-3 в дозе 5—10 микрограмм/кг подкожно ежедневно в течение 5—10 дней у пациентов с рецидивом лимфом, малоклеточным раком легкого, раком груди и раком яичников показали, что постхимеотерапевтическое применение IL-3 индуцирует более быструю регенерацию гранулоцитов и тромбоцитов. Роль применения только IL-3 в лечении миелопластического синдрома, апласти-ческой анемии и других болезней костного мозга была также разочаровы­вающей. Однако предварительное изучение 1L-3 в комбинации с химиотерапев-тическими агентами и иммуносупрессивной терапией продемонстрировали обнадеживающие результаты у пациентов с миелопластическим синдромом и апластической анемией. Терапевтический потенциал IL-3 в увеличении выхода стволовых клеток из периферической крови. Первые результаты по комбинированию IL-3 с GM-CSF или позднее—действующими факторами роста, такими, как гранулоцит-колониестимулирующий фактор показали увеличение выхода стволовых клеток периферической крови. В последние годы

175

доступность синтетического рецептора IL-3(IL-3R) и сходных химиерических молекул с большей активностью in vitro и меньшими воспалительными побочными эффектами увеличило возможности использовать и сравнивать эти молекулы и rhIL-З для предотвращения индуцированной химеотерапией миелосупрессии. Роль IL-3 и IL-3R в ex vivo экспансии стволовых клеток тре­бует дальнейшего изучения. Представляется, что будущее применение IL-3 в комбинации с другими цитокинами является привлекательным путем для предотвращения связанной с лечением смертности и заболеваемости у онкологических пациентов [34].

Таким образом, пролиферация стволовых клеток является сложно регулируемым процессом, в котором играют роль как межклеточные взаимодействия, так и растворимые факторы (цитокины и др.).

3.4.3. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ НАПРАВЛЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ВЫДЕЛЕННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ТИПЫ

КЛЕТОК IN VITRO

Целью регенеративной медицины является восстановление формы и функции поврежденных тканей. Один потенциальный терапевтический подход включает использование аутологичных клеток, полученных из костного мозга. Прогресс в трансплантации ядер, образование экспериментальных гетеро-кариотических клеток и наблюдаемая пластичность экспрессии генов и фенотипа у различных типов свидетельствуют о пластичности ядра. Последние исследования расширили эти открытия и показали, что эндогенные клетки в костном мозге обладают способностью включаться в дефектные ткани и ре-программироваться. Независимо от механизма потенциал для новой экспрессии генов в клетках из костного мозга в тканях-реципиентах обещает развитие клеточной терапии как в пролиферирующих, так и в постмитотических тканях.

Стволовые клетки, представляющие наибольший интерес с точки зрения их применения в медицине, — это эмбриональные, гемопоэтические и мезенхимальные. Стволовые клетки — это недифференцированные клетки, способные как к самоподдержанию, так и к дифференцировке в зрелые специализированные клетки. По типу происхождения различают эмбриональ­ные и соматические стволовые клетки. Первые могут неограниченно поддерживаться в культуре и способны к дифференцировке во все клетки взрослого организма. Вторые обладают ограниченной способностью к дифференцировке и, возможно, ограниченным пролиферативным потенциалом. Важным для терапевтического применения, хотя и оспариваемым рядом ученых, свойством является пластичность соматических стволовых клеток, т. е. способность к контекст-зависимой дифференцировке в "неродственные" типы клеток. Предполагается, что дифференцировка большинства типов стволовых клеток происходит по принципу поэтапного иерархического созревания через промежуточные интенсивно пролиферирующие клетки — предшественники. Несмотря на перспективность эмбриональных стволовых клеток, ряд обстоятельств серьезно ограничивает их терапевтическое применение в ближайшем будущем. В то же время подходы, связанные с аутотрансплантацией гемопоэтических или мезенхимальных стволовых клеток,

176

уже начинают успешно использоваться в клинических испытаниях для лечения ишемии конечностей и последствий инфаркта миокарда. Очевидно, что применение стволовых клеток в медицине обещает кардинальный прогресс в лечении множества тяжелых заболеваний.

Понимание того, как соотносятся и взаимодействуют клеточные клоны, потомки введенных извне донорских стволовых клеток и существующие в организме реципиента собственные клоны этого клеточного фенотипа (химеризм), раскрытие механизмов природы этого явления поможет обосновать и механизмы терапевтической эффективности клеточной терапии.

Значительные успехи, достигнутые в изучении гемопоэза и существующие схемы дифференцировки стволовых клеток кроветворения (в том числе и изучаемых стволовых клеток) позволяют провести в клинических условиях (НЦХ, другие институты) комплексный анализ указанных выше проблем в рамках современных теоретических подходов.

Очевидно, что с этих позиций наиболее близкими к внедрению в клиническую практику сегодня являются гемопоэтические стволовые клетки костного мозга, пуповинно/плацентарной и периферической крови, поскольку в мировой практике имеется значительный, почти 40-летний опыт их клинического применения при ряде лечений почти 70 различных заболеваний.

Помимо способности стволовых клеток дифференцироваться в различные типы клеток, включая клетки сердца, они также способны стимулировать ангиогенез. Эти два основных свойства и объясняют их широкое клиническое применение в кардиологии. На сегодняшний день более детально изучены клеточные молекулярные механизмы, посредством которых эндотелиальные и гладкомышечные клетки взаимодействуют между собой. Эндотелиальные клетки сами могут инициировать формирование и рост эндотелиального канала (ангиогенез) в ответ на какое-либо стимулирование. Пре- и эндотелиальные клетки необходимы для дальнейшего формирования сосудов. Присоединение гладкомышечных предшественников обеспечивает сосуд эластичностью, вазомоторными свойствами и способностью реагировать на изменения перфузии тканей. Эта, более поздняя, стадия называется артериогенезом и играет ведущую роль в формировании коллатералей. Эндотелиальные предшественники могут быть выделены как из периферического кровотока, так и из костного мозга.

Таким образом, основное свойство стволовых клеток — дифференциро­ваться в другие типы клеток широко используется в регенеративной медицине. Различные типы стволовых клеток обладают различной пластичностью, т.е. способностью перепрограммироваться в тканях-реципиентах.

3.4.4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ

При криоконсервации с использованием криопротекторов основное внимание обычно уделяют следующим факторам:

• осмотическим повреждениям клеток вследствие внесения/удаления криопротектора;

. 177

• химической токсичности используемого криопротектора по отношению к ГСК, и в последующем по отношению к реципиенту;

• взаимному влиянию конечной концентрации криопротектора и скорости замораживания на сохранность ГСК.

Большинство лабораторий используют криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО). ДМСО является относительно нетоксичным веществом для ГСК. Добавление ДМСО является экзотермической реакцией, поэтому внесение охлажденного криопротектора рекомендовано проводить на ледяной бане. Время внесения криопротектора не оказывает существенного влияния на сохранность ГСК, что было доказано в опытах по добавлению ДМСО в течение 15—30 с, 5 и 15 мин. Обязательным условием является только постоянная скорость внесения. Применение ДМСО не исключает возможности использования дополнительных криопротекторов и биоантиоксидантов, таких как:

• аутологичная сыворотка;

• бычий сывороточный альбумин;

• пропилен гликоль;

• гидроксиэтиленкрахмал;

• трегалоза, естественный криопротектор для криофильных организмов;

• мембранный стабилизатор таурин;

• биоантиоксиданты: б-токоферол ацетат, аскорбиновая кислота и каталаза.

Существуют коммерческие разработки, позволяющие автоматизировать процесс подготовки лейкоцитарной фракции к криоконсервации. Например, Coolmix Device—система для охлаждения и смешивания лейкоцитов образца, полученных после сепарации с использованием Sepax, с криопротекторами. Лейкоциты, помещенные непосредственно в контейнер для замораживания, охлаждают до +4°С в течение 10 мин и вносят смесь ДМСО/декстран, что позволяет сократить время и минимизировать клеточные потери на этапе подготовки к криоконсервации.

Скорость замораживания может оказывать существенное влияние на восстановление ГСК после криоконсервации. Очень быстрое замораживание (100°С/мин) приводит к гибели более 95% клеток. При очень медленном замораживании (0, ГС/мин) доля жизнеспособных клеток составляет около 25%. Наиболее оптимальной признана скорость 1—2,5°С/мин (Hunt, 2003). Также было показано отсутствие достоверных различий по жизнеспособности ГСК, замороженных со скоростью ГС/мин и 5°С/мин (Donaldson, 1996). В связи с этим в большинстве лабораторий и во многих банках замораживание проводят по следующей схеме: ГС/мин до —20°С (—40°С), 4°С/мин до -50°С или —80°С, после чего образцы помещают в жидкий азот (-196°С).

Наиболее востребованной коммерческой системой для долгосрочного хранения пуповинной крови является BioArchive®System (Thermogenesis Corp., USA), которая рассчитана на единовременное хранение 3626 образцов. Основным преимуществом данной системы можно считать закрытость процедур помещения образцов на хранение, собственно хранения и извлечения образцов, что исключает поступление внешнего тепла к уже находящимся в

178

жидком азоте образцам. Известно, что кратковременные повышения температуры, которые возникают при открытии обычного сосуда для хранения жидкого азота, могут значительно снижать жизнеспособность клеток в помещенных на хранение образцах. Благодаря наличию в BioArchive®System специальных автоматических рук, оснащенных крюком для захвата и устройством для считывания идентификационного кода, образец можно помещать сначала в специальный переходный модуль, а затем, изолировав от других образцов, извлекать из аппарата.

Современным направлением исследований в области длительного хранения ГСК является разработка методов лиофильной сушки (freeze-drying). Поливинилпирролидон (PVP) в конечной концентрации 40% добавляют во фракцию мононуклеаров пуповинной крови. Данное вещество обладает мощным гигроскопическим действием. Затем добавляют сахарозу в конечной концентрации 20% и маннитол или бычий сывороточный альбумин в конечной концентрации 10%. Полученную смесь замораживают до температуры —30°С и проводят первый этап вакуумной сушки. Второй этап проводят при температуре 15°С. Вся процедура занимает около 52 ч. Высушенные образцы перед использованием разводят в растворе на основе изотонического фосфатно-солевого буфера. Жизнеспособность мононуклеаров после подобной обработки составляет около 75% при использовании маннитола и около 98% при использовании БСА, сохранность ГСК—около 69%.

Таким образом, разработка методов длительного хранения стволовых клеток является приоритетным направлением исследования в рамках данной Программы, обеспечивающее создание Банка стволовых клеток в нашей суверенной республике и для последующего проведения фундаментальных исследований в изучении биологии стволовых клеток.

3.5. ПРАВОВЫЕ И ЭТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

Прогресс науки заключается в разработке и внедрении новых технологий. Но когда дело касается медицинского прогресса, то не следует забывать, что большинство новых диагностических, терапевтических и профилактических мероприятий несет в себе определенную долю риска. Поэтому так важно правильно выстроить все взаимоотношения врача и пациента, врача и общества. И тут на первый план выходит закон. В мире уже разработана серия международных документов по правам человека и медицинской этике. Точкой отсчета является Всеобщая декларация прав человека, принятая в 1948 г., за которой последовали Нюрнбергский кодекс, Хельсинская и Лиссабонская декларации, а гораздо позднее, в 1994 г., и Программа действий Международной конференции по народонаселению и развитию. Во всех этих документах подчеркивается необходимость соблюдения определенных базовых принципов, предусматривающих обоснованность проведения биомедицинских исследова­ний, компетентность и ответственность специалиста, информированность каждого потенциального объекта и его согласие на эксперимент. Обозначена и главная обязанность врача—это защита жизни и здоровья пациента. Кстати, эта тема акцентирована с особенной четкостью в Концепции о защите прав и достоинства человека в связи с достижениями биологии и медицины.

179

Все мероприятия, начиная с получения материала-источника стволовых клеток до процедуры клеточной терапии, должны проводиться с соблюдением существующих правовых, юридических и этических норм Республики Казахстан, а также других нормативных документов и рекомендаций GMP, GLP, GCP, касающихся этой развивающейся области медицины.

Клеточная терапия с использованием стволовых/прогениторных клеток может быть применена лишь в случаях, когда традиционные методы хирургического и терапевтического лечения не могут гарантировать сохранение жизни или улучшение состояния здоровья пациента, а также с его письмен­ного согласия.