2. Введение

В Стратегии развития Республики "Казахстан -2030", Стратегии индустриально-инновационного развития страны на 2003—2015 гг., Послании Президента Республики Казахстан народу Казахстана от 18 февраля 2005 г. "Казахстан на пути ускоренной экономической, социальной и политической модернизации", Государственной программе реформирования и развития здравоохранения Республики Казахстан на 2005—2010 гг., утвержденной Указом Президента Республики Казахстан от 13 сентября 2004 г. № 1438, Послании Президента Республики Казахстан народу Казахстана от 1 марта 2006 г. "Стратегия вхождения Казахстана в число пятидесяти наиболее конкурентоспособных стран мира" в качестве первоочередных задач указано на разработку новых технологий и современных методик лечения и медицинского обслуживания.

156

Характерной особенностью развития медицинской науки на современном этапе является быстрая реализация результатов фундаментальных исследований в новых технологиях лечения заболеваний человека, которые являются важными составляющими экономического процветания государств и основой их конкурентоспособности в XXI в. Современные мировые биологические технологии (генная инженерия, клонирование, генодиагностика и генотерапия заболеваний, стволовые клетки, нанотехнологии) уже вошли в медицинскую практику развитых зарубежных государств.

По заключению экспертов Организации Объединенных Наций, в XXI в. биотехнология будет определять развитие человечества во всех сферах его деятельности и, в первую очередь, в получении продуктов питания, медицинских препаратов, в сельском хозяйстве, экологии, энергетике.

Сегодня в ведущих лабораториях мира создаются различные технологии и препараты на основе модифицированных стволовых клеток и в ближайшие десять лет можно ожидать их появление на рынке. Речь идет о некоторых новых принципиальных направлениях:

—геномодифицированных стволовых клетках;

— трансфецированных различными вирусными векторами стволовых клетках;

—терапевтическом клонировании;

— создании функционирующих химер из стволовых клеток различных биологических видов.

В настоящее время развитие клеточных технологий и клеточной терапии в Казахстане характеризуется морально устаревшей научно-лабораторной базой, малочисленностью количества групп специалистов, занимающихся в данной сфере медицинской науки. Это обуславливает низкий уровень научных исследований. В свою очередь, низкий уровень исследований не создает стимулов для финансирования научных исследований. Отрицательный эффект многократно усиливается следующими факторами:

• отсутствием достаточного финансирования известных своими работами коллективов ученых;

• отсутствием эффективного международного сотрудничества;

• отсутствием целенаправленной подготовки кадров;

• отсутствием научной инфраструктуры в масштабе государства.

Тем не менее, в рамках бюджетных программ в Казахстане в последние годы проводились исследования, соответствующие приоритетным направ­лениям развития клеточных технологий на базе следующих научных организаций:

• Национальном научном центре хирургии им. А.Н.Сызганова МЗ РК (Академик HAH PK М.А.Алиев);

• НИИ кардиологии и внутренних болезней МЗ РК;

• НИИ проблем биологической безопасности (директор, профессор С. М. Мамедалиев);

• Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина МОН РК (директор, академик НАН РК Н. А. Айтхожина).

157

Однако вне зависимости от того, будет или не будет развивать Казахстан собственные клеточные технологии лечения заболеваний, в условиях глобализации науки и технологии республика будет втянута в потребление продукции мировой биотехнологии в области производства и использования стволовых клеток и их дериватов (производных).

Казахстан не должен стать опытной лабораторией развитых стран мира. Для недопущения негативных последствий экспансии на медицинский рынок недобросовестных зарубежных и собственных клеточных технологий (фетальная терапия) необходимо поставить надежную защиту, для чего Казахстану надо иметь высококвалифицированные научные кадры и собственные научно-исследовательские организации республиканского уровня, соответствующие мировым стандартам службы контроля и мониторинга использования импортных и отечественных клеточных технологий лечения заболеваний человека.

Настоящая Программа базируется в основном на разработанной под руководством академика НАН РК, лауреата государственных премий РК, Халык капарманы, профессора М. А. Алиева группой ученых Казахстана Концепции по изучению и использованию стволовых клеток.

Основные цели и задачи Концепции, этапы ее реализации и ожидаемые результаты были обсуждены и одобрены на состоявшемся в г. Алматы 29 мая 2006 г. заседании рабочей группы Министерства здравоохранения РК.

Миссией предлагаемой настоящей Программой является развитие клеточных технологий и клеточной терапии (трансплантации) в Казахстане — создание наукоемких и инновационных разработок в области клеточных технологий, внедрение новых технологий лечения в отечественную и международную медицинскую практику.

3. АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Начало XXI в. ознаменовалось рядом крупнейших достижений молекуляр­ной и клеточной биологии, открывающих широкие перспективы для создания принципиально новых и эффективных биомедицинских клеточных технологий, которые дадут возможность решить проблему лечения ряда тяжелейших заболеваний человека.

Успешное внедрение в практику экспериментальной медицины методов длительного культивирования стволовых клеток и клеток- предшественников различных тканей животных и человека, выделенных из эмбрионов, плодов и различных тканей взрослых организмов, создали предпосылки разработки технологий заместительной клеточной и тканевой терапии.

Дальнейшее развитие фундаментальных исследований механизмов клеточной дифференцировки и регенерации тканей, создание, разработка новых биомедицинских технологий клеточной и генной терапии целиком зависит от наличия адекватного клеточного материала, не вызывающего иммунного отторжения трансплантатов.

Существенное значение для развития методов заместительной терапии имеет использование в качестве трансплантационного материала эмбриональ-158

ных стволовых клеток человека, полученных из бластоцист, стволовых клеток и клеток-предшественников, выделенных из тканей эмбрионов, плодов и взрослых. Эти клетки, в их совокупности, характеризующиеся высоким пролиферативным потенциалом in vitro, обладают способностью дифферен­цировки практически в любые клетки органов и тканей человека на всех этапах постнатального онтогенеза.

В связи с поисками новых путей решения проблемы заместительной терапии с использованием стволовых и прогениторных клеток-предшественников внимание биологов и клиницистов привлекла способность этих клеток давать начало различным типам специализированных соматических клеток под влиянием ряда индуцирующих ростовых факторов и сохранять эту способность после длительной криоконсервации.

Широкие возможности применения стволовых клеток для клеточной заместительной и восстановительной терапии были положительно оценены в США, Англии, Германии, Японии и ряде других стран. В США, несмотря на существующий до последнего времени запрет на государственную поддержку работ согласно инструкции Национального Института Здоровья (NIH USA) по выделению стволовых клеток из эмбрионов человека, работа с линиями таких клеток разрешена частным лабораториям и биотехнологическим компаниям, включая разработку методов получения линий клеток человека и терапевтического их использования. Среди них такие, как Geron Corporation, Stem Cell Inc. и др. В 2000 г. создан специализированный некоммерческий институт WiCell, в задачи которого входит изучение стволовых клеток человека.

Влиятельная организация пациентов (Patients Coalition for Urgent Re­search), играющая определяющую роль в распределении средств на биомедицинские цели, провела скрининг возможного охвата больных США, нуждающихся в клинических технологиях, основанных на использовании стволовых клеток человека. Анализ показал, что только по следующим основным группам заболеваний: сердечно-сосудистым, онкологическим, аутоиммунным, диабету, остеопорозу, болезням Альцгеймера и Паркинсона, повреждениям позвоночника, порокам развития, число потенциальных пациентов может составлять около 128 млн. человек. В этот список не включены пациенты с глубокими ожогами и ранами других этиологии, для лечения которых также необходимы стволовые клетки.

В связи с вышеизложенным есть основания полагать, что в США поддержка фундаментальных и прикладных исследований стволовых клеток человека получит статус национальной программы с финансированием, сопоставимым с тем, которое ранее получила программа "Геном человека".

В Российской федерации разработана и утверждена Российской академией медицинских наук программа "Новые клеточные технологии в медицине".

В то же время причинами отставания отечественных исследований проблемы стволовых клеток от современного уровня аналогичных зарубежных разработок в этой области является отсутствие финансирования, необходимой национальной инфраструктуры (специализированные институты и центры, банки стволовых клеток), а также нормативно-правовой и этической базы

159

реализации результатов фундаментальных исследований в клинической практике. Сказывается и отсутствие подготовленных к этой области исследований, в том числе и за рубежом, квалифицированных кадров ц специалистов.

3.1. СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КАК ОБЪЕКТ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

Стремительный прогресс клеточной и молекулярной биологии в последнее десятилетие привел к принципиально новому пониманию биологии человека. Концептуально это новое понимание заключается в том, что в организме человека существует механизм восстановления тканей, утраченных или раз­рушенных в результате неблагоприятных внешних воздействий или патоло­гического процесса, связанный с существованием стволовых клеток (СК), под которыми понимают недифференцированные (неспециализированные) соматические клетки, способные превращаться в клетки любого типа тканей. Одним из важнейших свойств СК является способность к длительному самоподдерживающемуся росту без утраты исходных свойств. Различают несколько типов СК по их потенциальной способности давать начало тем или иным типам специализированных клеток: (1) тотипотентные СК, к которым относятся зигота (оплодотворенная яйцеклетка) и бластомеры (клетки заро­дыша на стадии двух-трех делений зиготы); (2) плюрипотентные (полипотент-ные) или эмбриональные СК, представляющие собой клетки внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты; (3) мультипотентные СК, включающие эпителиальные СК кишечника, эпидермиса кожи, гемопоэти-ческие СК костного мозга. Последний тип СК представляет наибольший интерес в плане клеточной биотехнологии. Гемопоэтические СК (ГСК) обладают очень высокой пластичностью, т. е. способны дифференцироваться практически в любые типы клеток, например, в гепатоциты, эндотелий печени, эпителий почечных канальцев, инсулин-продуцирующие клетки поджелудоч­ной железы, кардиомиоциты, пневмоциты, нейроны, астро- и микроглию. Их использование не связано с этическими проблемами, как в случае с эмбриональ­ными СК, поскольку их источниками служат костный мозг, периферическая и пуповинная кровь. К настоящему моменту сложилось представление, что в случае какого-либо тканевого повреждения гибнущие клетки посылают в кровь химический сигнал, а костный мозг под влиянием этого сигнала выбра­сывает в кровь СК, которые, достигнув места повреждения, трансформируются в нужный ввд ткани. Этот феномен получил название "пластичность", с кото­рой связано новейшее направление в клеточной терапии, позволяющее на­деяться на кардинальное решение проблемы лечения большой группы тяже­лейших соматических заболеваний, таких как инфаркт миокарда, инсульт, мышечная дистрофия, неврологические расстройства, аутоиммунные болезни, диабет, туберкулез кожи, болезни мышечной и хрящевой ткани. Совершенно очевидно, что успех клеточной терапии стволовыми клетками зависит от интен­сивности научных исследований в области фундаментальной биологии и биотехнологии ГСК.

Программа рассчитана на изучение и перспективное использование в качестве объекта клеточной терапии стволовых клеток или продуктов на их

160

основе (клеточных линий), полученных из указанных выше источников в организме человека с учетом существующих правовых и этических норм.

При разработке способов и методов выделения стволовых клеток предпочтение должно отдаваться методикам, обеспечивающим использование наиболее доступного материала для выделения клеток; наибольший выход жизнеспособных клеток с высоким запасом пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке; получение воспроизводимых и статистически достоверных результатов; безопасность последующего клинического применения.

Особое внимание следует уделять разработке новых методов или модификации известных методик, направленных на получение стволовых клеток в количестве, достаточном для обеспечения высокой эффективности клеточной терапии. Основу методик должны составлять приемы, исключаю­щие присутствие в образцах (в т.ч. в составе сред для культивирования и хранения клеток) токсических компонентов животного или растительного происхождения, а также реагентов, не предназначенных для клинического применения и (или) способных причинить вред здоровью пациента. При разработке методических приемов, направленных на получение конечного продукта клеточной терапии, следует исходить из возможности его использования для лечения, как хронических, так и неотложных (острых) состояний и заболеваний.

3.2. КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Исследованию в плане перспективы использования заместительной или восстановительной клеточной терапии с применением гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток должен быть подвергнут широкий спектр приобретенных и наследственных терапевтических и хирургических заболеваний, а также ряд других острых и хронических синдромов и состояний.

Проблема размножения ГСК ex vivo. Считается, что основная проблема использования ГСК для трансплантации заключается в том, что получаемых из одной порции пуповинной крови, хватает только для проведения трансплантации пациентам с весом, не превышающим 10—20 кг, т. е. детям.

Поскольку выход СК из пуповинной крови очень низкий (не более 1— ЗхЮ⁵ клеток на один образец по данным колониеобразования и около 5х10⁵ CD34⁺ клеток) разработка методов размножения пуповинных СК в условиях ex vivo находится под особым вниманием специалистов. Установлено, что СК практически не размножаются при культивировании в бессывороточной среде, не могут прикрепиться к пластиковой подложке и проявляют склонность к апоптозу. Фетальная телячья сыворотка является очень хорошим ростовым компонентом питательной среды для СК любого происхождения. Однако ее использование для культивирования человеческих клеток, предназначенных для трансплантации, нежелательно из-за возможной контаминации ее инфекционными агентами животного происхождения, а также из-за отсутствия точных сведений о содержании в ней всех ростовых факторов и, следовательно, невозможности строгого контроля количественного состава питательной

161

среды. Считается, что идеальная питательная среда для культивирования CR должна быть свободна от фетальной сыворотки, содержать химические компоненты, ее замещающие, и включать различные цитокины рекомби-нантного происхождения. Наиболее удачная замена фетальной сыворотки ддя культивирования эмбриональных СК была разработана на основе удаления всех ростовых компонентов методом генетического "нокаута". Все попытки культивирования мультипотентных гемопоэтических, мезенхимальньгх нейральных СК в культуральной среде в отсутствии фетальной сыворотки и ее заменителей не увенчались успехом. Предпринимаются попытки модифицировать питательную среду для культивирования СК, в том числе пуповинного происхождения, путем обогащения рекомбинантными ростовыми цитокинами. В результате наблюдается усиление роста клеток в четыре и более раз, и дифференциация СК в ранние предшественники миелоидного и лимфоидного направления. Хорошие перспективы показывают работы, посвященные использованию различных химических добавок небелкового происхождения в качестве ростовых факторов.

Таким образом, разработки в области создания идеальной культуральной среды для СК осуществляются широким фронтом по всему миру, поскольку составляют значительную часть технологии клеточной терапии, и без существенного прогресса в этой области невозможно рассчитывать на массовое применение этого многообещающего метода лечения.

Пластичность ГСК. Наиболее впечатляющим свойством ГСК, с которым связывают заманчивые перспективы клеточной репаративной терапии, без сомнения является пластичность ГСК, т. е. способность превращаться в другие типы клеток при соответствующих условиях. Так, в экспериментах на грызунах была показана способность ГСК дифференцироваться в скелетные мышцы, кардиомиоциты, нейроны, клетки печени, клетки эндотелия и эпителия. Однако есть работы, отрицающие превращение ГСК в клетки сердечной мышцы в модельных опытах инфаркта миокарда. В то же время было показано, что при экспериментальной модели инфаркта миокарда наблюдается трансдиффе-ренцировка ГСК в предшественники эндотелиоцитов в сердечной мышце. Таким образом, вопрос о трансдифференцировке ГСК остается открытым.

Хоуминг ГСК. Возникшее противоречие, возможно, снимается благодаря исследованиям молекулярных механизмов хоуминга ГСК, т. е. направленной миграции клеток в свою тканевую нишу или область повреждения. Самым изученным фактором хоуминга для ГСК является белок SDF-1 (stroma-de-rived factor-1). Он продуцируется стромальными клетками костного мозга и удерживает ГСК в своей стволовой нише за счет экспрессии на их поверхности рецептора для хемокинов CXCR-4. Имея такой рецептор, ГСК мигрируют в сторону большей концентрации SDF-1. Вводя этот белок в экспериментально ишимизированные участки сердца, мышцы конечности или головного мозга, исследователи наблюдали интенсивную миграцию ГСК в зону повреждения, после чего последние дифференцировались в клетки тканевого микро­окружения. Изучаются и другие молекулы, образующиеся в месте повреждения и привлекающие ГСК.

Перспективное направление в клеточной терапии ГСК представляет собой

162

использование факторов, мобилизующих ГСК из костного мозга. К таким факторам относятся колониестимулирующие цитокины типа G-CSF и GM-CSF. Российские ученые интенсивно изучают возможность вовлечения в репарационный процесс собственных ГСК больного, например, при инфаркте миокарда, путем стимуляции их выброса из костного мозга. Считают, что механизм мобилизационного действия G-CSF связан с тем, что он является функциональным антагонистом SDF-1, т. е. приводит к разобщению этого хемокина с рецептором CXCR-4 на поверхности ГСК и, следовательно, к высвобождению ГСК из костного мозга.

Иммуномодулирующие свойства ГСК. Большое значение имеет вопрос о взаимоотношениях ГСК и клеток иммунной системы, особенно в очаге тканевого повреждения, ввиду необходимости подавления иммунного ответа на аутоантигены, возникающие в результате тканевого повреждения. Существуют достаточно серьезные основания, включающие клинические наблюдения и экспериментальные данные, позволяющие признать иммуноре-гуляторную функцию у ГСК. Так, клинические наблюдения результатов немиелоаблативных трансплантаций высокоочищеннных фракций ГСК, выделенных с помощью иммуномагнитной сепарации, выявили высокую частоту осложнений в виде оппортунистических вирусных инфекций, в том числе вызываемых цитомегаловирусом, в результате возникшей иммунодепрес-сии. С другой стороны, высокая приживляемость ГСК-трансплантатов при аллогенных трансплантациях, может свидетельствовать об индукции толерантности к чужеродным антигенам. Возможная причина этих явлений заключается в особой регуляторной функции ГСК и ранних гемопоэтических предшественников. Эта функция, которая изучается уже более 30 лет, опреде­ляется как натуральная иммуносупрессия и связывается с так называемыми NS-клетками.

NS -клетки являются малодифференцированными костно-мозговыми гемопоэтическими предшественниками или ГСК. Они несут на своей поверх­ности маркер стволовых клеток CD34 и рецепторы к некоторым лектинам (WGA, SBA). У них отсутствуют популяционные маркеры зрелых Т-, В-клеток и моноцитов/макрофагов. Свое название они получили благодаря способности угнетать различные иммунологические реакции и рост опухолевых клеток в условиях in vitro без участия антигенов главного комплекса гистосовмести-мости. Эти клетки обнаруживают постоянно в костном мозге, а также в селе­зенке после обработки животных циклофосфамидом или гамма-иррадиацией.

К настоящему времени в Казахстане удалось разработать метод получения обогащенной фракции NS-клеток из костного мозга и существенно унифицировать метод тестирования их иммуносупрессорной активности. Доказано, что 74% клеток такой фракции принадлежит к популяции ГСК, несущих маркер CD34. Показана гетерогенность ГСК, различающихся по степени зрелости, и идентифицированы супрессорные факторы, синтезируе­мые этими клетками. В условиях эксперимента изучены их иммуносупрес-сорные эффекты. Высокие корреляции между падением активности NK-клеток и ростом активности NS-клеток позволили обозначить функцию ГСК при опухолевом процессе, как негативную, что в практическом плане выдвигает

163

задачу разработки способов торможения избыточной активности ГСк Остается неясной роль различных субпопуляций TCK/NS-клеток в формировании иммунологической недостаточности, индуцированной опухолевым ростом.

Казахстанскими исследователями предполагается, что при аутоиммунных заболеваниях имеет место недостаточность циркуляции ГСК в периферическом кровотоке или существует нарушение функциональной активности циркулирующих ГСК, в частности, иммуносупрессорной активности, что в результате приводит к срыву иммунной толерантности к аутоантигенам. Именно поэтому введение больным с аутоиммунными заболеваниями больших количеств CD34+ ГСК способствует восстановлению аутотолерантности и соответственно, высокому клиническому эффекту.

Гипотеза репаративно-иммунологического надзора ГСК. Литературные данные и результаты, полученные казахстанскими учеными, позволяют предложить рабочую гипотезу репаративно-иммунологического надзора, осуществляемого циркулирующими ГСК в организме. В норме в организме поддерживается циркуляция в периферической крови небольшого количества ГСК. В случае нарушения целостности какой-либо ткани в поврежденном очаге начинают образовываться факторы, вызывающие хоуминг ГСК, которые мобилизуются из циркуляции. Одновременно идет мобилизация ГСК из костного мозга. В результате в области поражения скапливаются ГСК, осуществляющие репарацию поврежденной ткани. Эти клетки секретируют супрессорные факторы, формирующие локальную зону иммуносупрессии, которая в данном случае необходима для предотвращения местного воспаления, препятствующего репарации.

В случае опухолевого процесса супрессорная активность ГСК оказывается вредной, поскольку способствует подавлению противоопухолевого иммунитета.

Таким образом, перспективность исследований ГСК с целью их использова­ния для клеточной репаративно-регуляторной терапии совершенно очевидна.

При выборе тактики клеточной терапии следует учитывать возможность использования как аллогенных (донорских) так и аутологичных (от того же пациента) стволовых клеток. Можно предполагать, что на первых этапах исследования применение ГСК из пуповинной крови (при их достаточном количестве) может оказаться более практичным, поскольку не требует строгого отбора совместимой пары донор-реципиент, как это принято при трансплантации других гемопоэтических стволовых клеток. В дальнейшем, с совершенствованием процедур выделения, размножения и длительного хранения стволовых/прогениторных клеток из других источников, выбор тактики может корректироваться в зависимости от конкретных целей и существующих условий.

3.3. НАПРАВЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА

Единая теория стволовых клеток организма человека отсутствует, нет определенности в информации о детальной судьбе стволовых/прогениторньгх

164

клеток, введенных извне в организм детей и взрослых. Решение этой ключевой проблемы видится в накоплении новых, ранее не известных данных о путях дифференцировки и трансдифференцировки стволовых/прогениторных клеток, процессах регуляции и контроля взаимодействия различных клеточных популяций на всех этапах эмбриогенеза и онтогенеза человека.

Понимание того, как соотносятся и взаимодействуют клеточные клоны, потомки введенных извне донорских стволовых клеток и существующие в организме реципиента собственные клоны этого клеточного фенотипа (химеризм), раскрытие механизмов природы этого явления поможет обосновать и механизмы терапевтической эффективности клеточной терапии.

Значительные успехи, достигнутые в изучении гемопоэза и существующие схемы дифференцировки стволовых клеток кроветворения (в том числе и изучаемых стволовых/прогениторных клеток) позволяют провести в клинических условиях (НЦХ, другие институты) комплексный анализ указанных выше проблем в рамках современных теоретических подходов.

Очевидно, что с этих позиций наиболее близкими к внедрению в клини­ческую практику сегодня являются гемопоэтические стволовые/прогенитор-ные клетки костного мозга, пуповинно/плацентарной и периферической крови, поскольку в мировой практике имеется определенный начальный опыт их клинического применения при ряде заболеваний, в том числе и заболеваний сердца.

Применение гемопоэтических стволовых клеток в онкогематологии. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток—самый современный и эффективный способ лечения многих гематологических, онкологических и. наследственных заболеваний. Последние 12 лет в Научном Центре педиатрии и детской хирургии дети с онкогематологическими заболеваниями получают лечение по протоколам БФМ (Германия), которые считаются одним из современных и эффективных методов лечения детей с данной патологией в мире. Достигнутые результаты в лечении детей с онкогематологическими заболеваниями в РК, приближенные к мировым показателям, не утешают, так как существуют определенные группы больных, которые не поддаются химиотерапевтическому лечению и вопрос о пересадке костного мозга у них является вопросом жизни. Выживаемость детей с ОМЛ после трансплантации костного мозга достигает 80%, в то время как эффективность современных протоков химиотерапии этой формы лейкоза только 29—39%. Кроме того, трансплантация костного мозга является единственным методом лечения хронического миелолейкоза и апластической анемии, а также терапией выбора при ряде других гематологических и онкологических заболеваний таких, как: наследственные нейгропении, наследственные гемоглобинопатии, врожденные иммунодефициты, наследственные обменные заболевания, солидные опухоли и т. д. В настоящее время больные с указанными заболеваниями в нашей республике погибают. Актуальность интенсификации работ в области трансплантации костного мозга (ТКМ) определяется уже достигнутыми мировыми результатами, показавшими, что трансплантация гистосовмес-тимого костного мозга в условиях предварительной иммунодепрессии больным ОЛ в фазе ремиссии, детям с рецидивами острого лимфобластного лейкоза

165

(S₃, S4 группы риска), всем детям с рецидивами острого миелобластного лей­коза, а также тяжелых апластических анемий на ранних этапах заболевания может способствовать получению полных клинико-гематологических ремис­сий, не требующих в дальнейшем поддерживающей терапии у 65—100% больных. Поэтому использование этого метода лечения заболевания системы крови безусловно, является необходимым. Ежегодно по нашим ориентировочным сведениям в трансплантации костного мозга нуждаются только по онкогемато-логии 80—100 детей по республике. Таким образом, существует острая необхо­димость создания отделения трансплантации костного мозга для детей с онко-гематологическими заболеваниями, врожденными и наследственными заболе­ваниями, протекающими с поражением кроветворной и иммунной систем.

По статистике не более 30% пациентов, нуждающихся в трансплантации костного мозга, имеют совместимого потенциального родственного донора, остальным больным рекомендуется неродственная трансплантация. Далеко не каждый человек может стать донором для конкретного больного. Несмотря на то, что Международный донорский регистр насчитывает около 6 млн. потен­циальных доноров, только 80% больных, нуждающихся в неродственной ТКМ, могут найти в нем полностью совместимого донора. Впрочем, современное состояние трансплантологии позволяет использовать при пересадке клетки донора, чей фенотип совпадает с фенотипом больного не по всем, а по боль­шинству позиций. Наиболее высоки шансы найти совместимого донора в банке данных потенциальных доноров схожей этнической группы. Легче найти донора среди наших этнических групп, кроме того, в 25% донорами могут быть братья и сестры, а для нашего населения характерна многодетность. Второе обстоятельство в пользу создания казахстанской донорской базы то, что услуги иностранных донорских регистров обходятся нашим больным в десятки тысяч долларов.

Поскольку трансплантация является сложной и токсической процедурой, чреватой тяжелыми инфекционными и органными осложнениями, очень важно приложить все усилия, чтобы пациент подошел к пересадке в наилучшем клиническом состоянии, будучи способным перенести высокодозную химиотерапию, период нейтропении, полный объем иммуносупрессивной терапии, болезнь "трансплантат против хозяина" и т.д. Не будет преувели­чением сказать, что успех трансплантации не менее чем наполовину зависит от качества лечения пациента в клинике, откуда он был направлен в центр трансплантации. Именно поэтому знакомство детских гематологов/онкологов с некоторыми тонкостями процедуры трансплантации и выработка особых стандартов ведения кандидатов на трансплантацию ГСК является особенно важным. Например, использование нефро-, кардиотоксичных препаратов должно быть сведено к минимуму у потенциальных реципиентов. Все клеточные компоненты крови перед переливанием должны быть освобождены от ] лейкоцитов и облучены и многое другое.

Таким образом, получены вдохновляющие результаты лечения лейкозов, коренным образом изменилась ситуация с онкогематологическими заболева­ниями в республике. Обреченные дети с лейкозами и апластической анемией получили шанс на выздоровление.

166

Из сказанного ясно, насколько актуально внедрение ТКМ в практику здравоохранения РК для получения радикального эффекта при лечении лейкозов, апластических анемий, хронических миелолейкозов и некоторых врожденных наследственных заболеваний.

Применение гемопоэтических стволовых клеток в кардиологии.

Следует учесть, что ишемическая болезнь сердца (ИБС) остается одной из основных причин инвалидизации и смертности взрослого населения большинства развитых стран мира. В структуре летальности при заболеваниях системы кровообращения удельный вес ИБС достигает 47% (1). Для пациентов с ИБС, у которых традиционное лечение неэффективно или противопоказано ввиду серьезных сопутствующих заболеваний, потребность в альтернативной терапевтической стратегии не вызывает сомнений. Наиболее перспективным подходом является применение методов относительно новой отрасли медици­ны —регенерационной и восстановительной клеточной терапии. Как показано исследованиями последних лет, основной причиной развития КБС является атеросклеротическое поражение сосудистой стенки, что ведет к инфаркту миокарда и его последствиям. Считается, что степень атеросклеротического поражения сосудистой стенки и течение инфаркта миокарда может зависеть от степени апоптоза и пролиферации в этих тканях. Известно, что наряду с апоптотическими сигналами клетки миокарда получают и пролиферирующие сигналы. Поэтому степень и масштаб повреждения сердца в значительной мере зависят.от состояния медиаторов межклеточного взаимодействия. Так регуляторы межклеточного взаимодействия могут оказывать воздействие на организм, являясь одним из инициаторов процесса пролиферации стволовых клеток и, кроме того, оказывая воздействие на апоптотические сигналы клеток (Сепиашвили Р.И.,2000, Репин B.C., 2002). Исходя из этого, особую важность приобретают исследования, направленные на поиск и изучение методик, влияющих на апоптозные и пролиферирующие сигналы регуляции клеток миокарда и сосудистой стенки (Репин B.C., 2002). Поэтому необходимость пополнения арсенала средств при коррекции коронарной болезни сердца продолжает оставаться важной проблемой при лечении больных КБС.

Высокий уровень летальности от сердечно-сосудистых заболеваний во многом связан с неспособностью кардиомиоцитов к пролиферации. Погибшие или поврежденные клетки миокарда обычно замещаются соединительной тканью, что приводит к снижению сократительной способности миокарда и формированию сердечной недостаточности. При наличии кардиосклероза консервативное и хирургическое вмешательство не позволяет добиться хорошего и продолжительного улучшения в состоянии пациента и, по существу, такие программы лечения являются паллиативными. Это обстоятельство, а также бурное развитие фундаментальных исследований биологии и возможностей клинического применения стволовых клеток открыли новые перспективные направления в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Одной из перспективных программ является использование аутологичных СК с целью заместительной терапии при инфаркте миокарда.

Следует отметить, что по трансплантации СК при патологии сердечно­сосудистой системы предоставлено наименьшее количество сообщений. Это

167

обусловлено тем, что данное направление развивается в течение сравнительно небольшого периода времени — последних 5—7 лет. Однако уже накоплен довольно интересный экспериментальный и клинический материал, позволяющий надеяться на дальнейшее практическое применение этого метода. Возможности замещения погибшего миокарда гемопоэтическими СК при инфаркте миокарда были изучены в эксперименте на модели животных (США). Моделирование инфаркта миокарда осуществляли путем перевязки левой коронарной артерии. Через 5 часов после перевязки коронарной артерии выполняли трансплантацию в периинфарктную зону СК, окрашенных зеленым флуоресцирующим протеином. Уже через 9 дней после трансплантации отмечалась интенсивная миграция флуоресцирующих СК в зону инфаркта миокарда. Применение специальных меток показало, что флуоресцирующие клетки содержат кардиальный миозин и активно пролиферируют в зоне повреждения. Более того, среди вновь образованных мышечных клеток миокарда определялся процесс ангиогенеза, визиализируемый с помощью окрашивания альфа-актина волокон гладких мышц сосудов. Однако клинические работы по применению стволовых клеток неоднозначны и требуют дальнейшего изучения влияния стволовых клеток как на миокард больных КБС, так и на целый организм. В связи с вышеизложенным, есть настоятельная необходимость после получения положительных результатов доклинических испытаний аутологичных стволовых клеток в эксперименте проведения клинических испытаний у больных КБС.

Применение гемопоэтических стволовых клеток в кардиохирургии. Высокий уровень летальности при заболеваниях сердца во многом связан с неспособностью миокарда взрослого человека к регенерации. Погибшие или поврежденные его клетки замещаются соединительнотканным рубцом, что приводит к прогрессирующей потере функционирующего миокарда, снижению сократительной способности сердца и формированию сердечной недостаточ­ности. Консервативные методы лечения ИБС остаются симптоматическими. Что же касается большинства хирургических методов коррекции коронарного кровотока, то при наличии обширных постинфарктных рубцовых полей оперативное вмешательство не позволяет добиться продолжительного улучшения состояния пациента. Единственным эффективным методом лечения в подобных случаях является пересадка сердца. Однако в последние годы в мире отмечено снижение количества операций по кардиотрансплантации, что обусловлено в первую очередь дефицитом донорских органов.

Переворот в тактике лечения острого инфаркта миокарда может произвести установленная способность клеток костного мозга к дифференцировке в кардиомиоциты и сосудистые структуры, что существенно уменьшает признаки ишемического повреждения сердца. Исследователями (Jackson К. А., et al., 2001) показано, что клетки костного мозга, экспрессирущие c-Kit-лиганд, под влиянием G-CSF продуцируют фенотипические аналоги ангиобластов. После их инфузии крысам с ишемией миокарда такие ангиобласты мигрируют непосредственно в зону повреждения сердечной мышцы, где приостанавливают некротические изменения в кардиомиоцитах, формируя новые кровеносные сосуды. Однако авторы обращают внимание на то, что только максимально

168

раннее проведение клеточной трансплантации с момента возникновения ишемии позволяет предупредить процесс патологического ремоделирования миокарда.

Кроме прямого введения ГСК в поврежденную зону возможен и вариант "непрямой заместительной терапии" с использованием цитокинов, воздействие которых увеличивает количество циркулирующих в периферической крови кроветворных клеток-предшественников. В Национальном институте здоровья США была выполнена серия экспериментов, в ходе которых животным в течение 4 дней вводили G-CSF, что обеспечивало значительное повышение концентрации циркулирующих в крови ГСК. В последующем на пятые сутки у животных моделировали инфаркт миокарда. При гистологическом исследовании было установлено, что ГСК замещают погибшие кардиомиоциты стенки левого желудочка в области инфаркта, чего не наблюдалось у животных контрольной группы. На 27-е сутки вновь образованные кардиомиоциты характеризовались несколько меньшими размерами и были похожи на кардиомиоциты новорожденных. Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ГСК, трансплантированные в сердечную мышцу, могут трансформироваться в кардиомиоциты, а также формировать сосуды в зоне инфаркта миокарда. Эти процессы индуцированы репаративной регенерацией и сопровождаются улучшением функций миокарда и увеличе­нием выживаемости экспериментальных животных.

До сих пор возможность стимуляции регенерации сердечной мышцы остается достаточно спорным вопросом. Считается, что если возникло повреж­дение сердечной мышцы, то оно необратимо и проявляется репаративным ремоделированием миокарда, который закономерно заканчивается развитием сердечной недостаточности в течение нескольких месяцев или лет.

Из клинических исследований известно, что когда сердце уже транспланти­ровано, в нем остаются некоторые повреждения, и стволовые клетки реципиента (а не донора) активно включаются в работу восстановления нового органа, мигрируя в него. В большем количестве трансплантированных сердец были идентифицированы предполагаемые стволовые и прогениторные клетки (Quaini et al. 2002). Для идентификации мигрировавших недифференцированных клеток, экспрессирующих антигены стволовых клеток реципиента и полученных от донора прогениторных клеток была использована Y- хромосома.

Очень многообещающий способ обращения вспять или стабилизации процесса постинфарктного ремоделирования — прямое введение в постин­фарктный рубец клеток с регенерационным потенциалом. Такую терапию, основанную на введении клеток для регенерации сердца, называют клеточной кардиомиопластикой.

Метод клеточной трансплантации в настоящее время считается наиболее перспективным для стимуляции регенеративно-репаративных процессов в миокарде. Выделяют 3 основных подхода к решению данной задачи:

• Трансплантация клеток в миокард с целью привнесения клеток, которые могут заместить недостаток сократительных структур в сердечной мышце.

• Трансплантация клеток с целью стимулирования репаративных процессов в миокарде.

169

• Трансплантация клеток с целью стимулирования роста новых сосудов для ликвидации ишемии миокарда (васкулогенез и неоангиогенез).

В последние годы интерес исследователей к стимуляции развития новых кровеносных сосудов в миокарде значительно вырос. Стволовые клетки костного мозга могут использоваться для непосредственной индукции формирования новых кровеносных сосудов в инфарктной зоне (васкулогенез) и развития уже существующей сосудистой сети (ангиогенез) после экспериментального инфаркта миокарда. Неоангиогенез приводит к снижению апоптоза гипертрофированных миоцитов в периинфарктной зоне, длительному сохранению и переживанию жизнеспособного миокарда, сокращению коллагенообразования и существенному улучшению сердечной функции. Использование человеческих цитокин-мобилизованных аутологичных костномозговых ангиобластов для реваскуляризации инфарцированного миокарда (в качестве монотерапии или в сочетании с другими современными методами лечения) может значительно уменьшить осложнения и летальность, связанные с ремоделированием левого желудочка.

Проведенные экспериментальные исследования позволили перейти к первым клиническим исследованиям. Выбор клеточного материала для трансплантации кардиологическим больным исключает в настоящее время использование аллогенного и ксеногенного материала. Фетальные клетки не могут быть использованы в связи с наличием этических проблем при их использовании и необходимостью применения иммуносупрессантов. Применение взрослых аллогенных клеток ограничено из-за недостаточной изученности иммунологических реакций, которые протекают после введения, например, мезенхимальных стволовых клеток. Поэтому наиболее приемлемым источником является аутологичный костный мозг, в котором имеется значительное количество гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток.

Таким образом, в настоящее время метод клеточной трансплантации рассматривается большинством исследователей как перспективный. Метод уже применяется в клинической практике для улучшения прогноза у больных с сердечной недостаточностью различного генеза (ИБС, дилатационная и ишемическая кардиомиопатии и др.). Результаты пересадки аутологичных взрослых стволовых клеток костного мозга у больных ИБС, облитерирующих заболеваний периферических сосудов за рубежом и в России говорят об улучшении результатов традиционных методов лечения и, что немаловажно, о безопасности применения аутологичных клеток костного мозга в клинике: ни в одном из опубликованных клинических исследований не было указаний на развитие каких-либо осложнений, связанных с их применением.

Вместе с тем нельзя не отметить, что к настоящему моменту данных, позволяющих рекомендовать методы клеточной терапии для широкого внедрения в повседневную клиническую практику, недостаточно. Необходимы хорошо продуманные и качественно выполненные экспериментальные и клинические исследования, целью которых было бы определение эффектив­ности различных вариантов клеточной терапии при ишемической болезни сердца, разработка показаний и противопоказаний к использованию данного

170

метода, создание рекомендаций по комбинированию методов клеточной терапии с традиционными хирургическими и консервативными подходами к лечению ишемической болезни сердца.

3.4. БИОТЕХНОЛОГИЯ И СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

В современном мире биотехнологическая отрасль исследований стволовых клеток является одной из наиболее приоритетных и наукоемких областей человеческой деятельности. Авторитетный в научном сообществе журнал "Science", подводя итоги развития биологической науки в XX в., на третье место после открытия двойной спирали ДНК и расшифровки генома человека поставил открытие в человеческом организме клеток-предшественников, т.е. стволовых клеток. Эти клетки способны при определенных условиях превращаться в нервные, костные, мышечные и кровяные клетки.

Разработки по получению и применению стволовых клеток в значительной мере определяют престиж страны на мировом рынке высоких технологий. Анализ тенденций развития клеточных технологий в лечении ряда серьезных заболеваний человека свидетельствует о том, что ведущие страны мира стремятся развивать эту область исследований опережающими темпами. Созданы и создаются крупнейшие научно-исследовательские центры, как в развитых западных странах, так и в азиатском регионе (Корея, Сингапур, Япония).

Сотрудниками лаборатории "Клеточная биотехнология" филиала РГП "Национальный центр биотехнологий Республики Казахстан" МОН РК (пгт. Гвардейский) впервые в Республике Казахстан проводятся исследования в этом направлении. Для дальнейшего развития работ в этой области планируется расширить фундаментальные исследования, создать практические методы и разработать отечественную технологию выделения, культивирования и длительного хранения гемопоэтических стволовых клеток из различных источников (костный мозг, пуповинная и периферическая кровь) для клеточной терапии заболеваний человека, результаты которых будут конкурентоспособными в международном научном сообществе.