2 курс / Гистология / Лекции_по_гистологии_ТГМУ_ч_1

Таджикский

государственный медицинский университет им. Абуали ибни Сино.

КУРС ЛЕКЦИЙ

по гистологии

Душанбе-2008 г.

Лекция по теме: Введение в гистологию. Микроскопическая и гистологическая техника.

ГИСТОЛОГИЯ – (от греч. histos – ткань, logos – учение, наука) – наука о развитии, строении и функциях клеток, тканей и органов человеческого организма. Гистология как наука и учебная дисциплина состоит из нескольких разделов.

1.Гистологическая и микроскопическая техника изучает способы приготовления гистологических препаратов и методы их микроскопирования.

2.Цитология изучает развитие, строение и функции различных клеток организма.

3.Эмбриология представляет собой науку, изучающую закономерности эмбрионального развития животного организма.

4.Общая гистология изучает источники развития, строение, функции и реактивные изменения тканей организма.

5.Частная гистология изучает источники и ход эмбрионального развития, строение и функции органов организма человека.

Гистология относится к морфологическим наукам. Эта наука изучает в основном закономерности строения (морфологии) организма в отличие от наук физиологического профиля, которые изучают функцию органов, клеток и тканей. Однако такое разделение условно, и это особенно очевидно в последнее время. Если раньше гистология, как и все морфологические науки, имели чисто описательных характер, то в последнее время она превратилась в синтетическую науку, широко использующую современные морфофункциональные методы исследования, которые позволяют судить не только и не столько о строении, сколько о структурном обеспечении функций клеток, тканей, и органов. По этому между указанными двумя ветвями науки есть тесное взаимодействие.

Гистология относятся к фундаментальным биологическим дисциплинам, т.е. является основой для изучения других медико-биологических наук. В этом заключается их теоретическая значение. Однако существует и другой аспект значения этой дисциплин

– прикладной. В настоящее время без гистологических исследований трудно обойтись врачу любой специальности – патологическая анатомия с патогистологией, в которой гистологические методы исследования являются основными. Врач - патологоанатом не может обнаружить патологические изменение со стороны клеток, тканей и органов, не имея четких представлений об их нормальном строении. Таким образом, гистология формирует научно – практическую базу для патологической анатомии.

Гистология тесно связана с другими фундаментальными науками медикобиологического профиля: биологией, нормальной анатомией, нормальной физиологией, биологической химией, патологической физиологией.

Гистологическая техника твердо базируется на знаниях химических дисциплин а микроскопическая техника на знаниях таких разделов физики, как оптика (световая микроскопия) и физика элементарных частиц (электронная микроскопия). В месте все эти науки составляют теоретическую базу медицины.

Наука о клетке – цитология принадлежит к числу «счастливых» биологических дисциплин, развитие которых за последние годы было особенно стремительным и коротким, претерпев значительные изменения, получив, по существу, новое содержание.

Ещё несколько десятилетий назад цитология была обязательной, но очень скромной частью гистологии, как бы введением в эту дисциплину.

Теперь положение коренным образом изменилось и это нашло отражение в предлагаемом вниманию читателей пособии. В нем излагаются основные биологические проблемы в клеточном аспекте, так сказать, «с позиций клетки». В книге подчеркивается, что клетка является основным структурным и функциональным элементом организма, поэтому разрешение таких кардинальных

общебиологических вопросов, как механизм наследования признаков, рост организма, процессы регенерации, способы секреции, механизм нервного проведения и т.д., может быть плодотворным только в том случае, если эти вопросы будут рассматриваться на уровне клетки.

Цитология в последние годы обогатилась многими научными открытиями, внесшими существенный вклад в развитие биологических и медицинских наук и практику здравоохранения. Новые данные о структуре ядра, его хромосомного аппарата легли в основу цитодиагностики наследственных заболеваний, опухолей, болезней крови и других патологических процессов. Раскрытие особенностей ультраструктуры и химического состава клеточных мембран является основой для понимания закономерностей взаимодействия клеток в тканевых системах, защитных реакциях и др.

История цитологии.

Цитология является одной из самых молодых ветвей науки о жизни. Она выделилась в самостоятельную дисциплину в конце 19 века. Начало её развития теснейшим образом связано с созданием сложного микроскопа (греч. «микрос» – малый и «скопейн» – смотреть, наблюдать).

Термин клетка (греч. «китос» – клетка, лат. «целла» – полость) впервые употребил Роберт Кук (1665) при описании своих «исследований строения пробки при помощи увеличительных линз». В этих наблюдениях, позднее повторенных Грю и Мальпиги на различных растениях, были замечены только полости – «мешочки» или «пузырьки», ограниченные целлюлозными стенками. В конце 17-го века Антон Ван Левенгук (1674), обнаружив свободные клетки, отличающиеся от «замурованных» клеток Гука и Грю, установил, что вещество, находящееся внутри клеток, определённым образом организовано: в частности, он нашел ядра в некоторых эритроцитах. На этом уровне представление о клетке просуществовало более ста лет.

Возникновение цитологии, как науки тесно связано с созданием клеточной теории, пожалуй, самого широкого и фундаментального из всех биологических обобщений. Клеточная теория в её современном понимании утверждает, что все живые существа – животные, растения и простейшие организмы состоят из клеток и их производных. Эта теория представляет собой результат многочисленных исследований, проведенных в начале 19-го века (Марбель. 1802; Океан, 1805; Ламарк, 1809; Дютроше, 1824; Тюрпен, 1826) и, особенно, работ ботаника Шлейдена (1838) и зоолога Шванна (1839), который сформулировал эту теорию в окончательном виде.

Клеточная теория оказала плодотворное влияние на все направления биологических исследований. Как её прямое следствие было установлено, что каждая клетка образуется в результате деления другой клетки. Значительно позже, благодаря развитию биохимии удалось показать, что все клетки сходны по своему химическому составу и характеру метаболизма; в это время возникло представление, согласно которому функции организма, как целого, является результатом сложения активности и взаимодействий отдельных клеточных единиц.

В 1858 году Вирхов применил клеточную теорию в области патологии, а Кёлликер распространил её на эмбриологию, показав, что организм развивается в результате слияния двух клеток – яйца и сперматозоида.

Это же столетие было ознаменовано достижениями, имеющими общебиологическое значение: в 1831 г. Р. Броун установил, что ядро является важнейшим и неизменным компонентом клетки, а в 1832 г. Вагнер открыл ядрышко. Другие исследователи (Джарден, Шультце, Пуркинье и фон Моль) занимались изучением содержимого клетки, названного «протоплазмой».

Таким образом, первоначальное понятие о клетке превратилось в представление о массе протоплазмы, ограниченной в пространстве клеточной оболочкой и содержащей

ядро. Протоплазму, окружающую ядро, стали именовать цитоплазмой, в отличие от кариоплазмы, представляющую собой протоплазму ядра.

После того, как были установлены эти важнейшие факты и разработаны основные теории и представления, цитология начинает развиваться чрезвычайно быстро. Внимание многих исследователей привлекают необычайные изменения, происходящие в ядре при каждом делении клетки. Так, были открыты явления амитоза или прямого деления (Ремак

– 1852) и непрямого деления (обнаружено Флеммингом у животных и Страсбургером у растений). Непрямое деление описал также Шлейхер (1878) под названием кариокинеза; Флеминг называл его митозом. Позже были описаны главные особенности митоза – образование в ядре нитей или хромосом (Вальдейер, 1890) и их равномерное распределение между ядрами двух образующихся дочерних клеток. Столь же важное значение имело и открытие явления оплодотворения яйца и слияния двух пронуклеусов (О.Гертвиг, 1875), а также обнаружение в цитоплазме клеточного центра (ван Бенеден, Бовери), митохондрий (Альтман, Бенда, 1898) и ретикулярного вещества (Гольджи, 1899).

Изучая ткани, как клеточные агрегаты, биологи и медики всё чаще направляют свое внимание в сторону исследования клетки в качестве основной единицы жизни.

Задачи цитологии и связь с другими биологическим науками. Значение для медицины.

Цитология, как и другие биологические науки, решает главную задачу – выяснение структурной организации процессов жизнедеятельности и в связи с этим – возможности целенаправленного воздействия на них.

Исследования различных уровней организации живой материи в целостном организме должно базироваться на системном анализе, так как всякая структура является сложной системой, взаимодействующей с другими структурными элементами одинакового или различного уровня организации. Вот почему задачей цитологии является не только описание строения и функционального назначения структур, но и установление связей между ними, раскрытие закономерностей их развития.

Современная цитология вносит существенный вклад в разработку теоретических и прикладных аспектов современной медицины и биологии. К фундаментальным теоретическим задачам цитологии относятся:

1 – изучение закономерностей цитогенеза, строение и функции клеток; 2 – изучение закономерностей дифференцировки и регенерации клеток;

3 – выяснение роли нервной, эндокринной, иммунной систем организма в регуляции процессов морфогенеза клеток;

4– исследование возрастных изменений клеток;

5– исследование адаптации клеток к воздействию различных биологических, физических, химических факторов.

Цитология тесно связанна с преподаванием других медико-биологических наук – биологии, анатомии, физиологии, биохимии, патологической анатомии, а также клинических дисциплин. Так, раскрытие основных закономерностей структурной организации клеток является основой изложения вопросов генетики в курсе биологии. Современная цитология тесно связана, в частности, с анатомией, так как цитология изучает мельчайшие детали органов и тканей на микроскопическом и субмикроскопическом уровне. Тесная связь с физиологией выявляется при исследовании взаимозависимости структуры и функции органов и тканей. Если физиология изучает функции органов, то цитология – функции и структуры отдельных клеток, межклеточного вещества и даже отдельных частей клетки – ядра, цитоплазмы, митохондрий и др.

В настоящее время в цитологии активно изучают распределение химических веществ в клетках и их структурах, выясняется связь тонкого строения клеток с обменом веществ в них (цитохимия).

Патологическая анатомия и патологическая физиология базируется на данных цитологии. Увидеть и понять патологические изменения в органе невозможно без знаний его строения и особенностей функции в норме. В то же время данные этих наук, особенности изменения структуры при той или иной патологии позволяют цитологам глубже понять закономерности процессов, происходящих в клетках и значение тех или иных структур. В преподавании, научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли цитохимические данные. Знание нормальной структуры клеток являются необходимым условием для понимания механизмов изменений в них в патологических условиях. Поэтому цитология тесно связана с клиническими дисциплинами, такими как внутренние болезни, акушерство и гинекология и др.

Таким образом, цитология занимает важное место в системе медицинского образования, закладывая основы научного структурно-функционального подхода в анализе жизнедеятельности организма человека в норме и патологии.

Методы исследования в цитологии.

В современной цитологии применяются разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития, строения и функции клеток.

Главными этапами цитологического анализа являются выбор объекта

Объектами исследования служат живые и мертвые клетки (фиксированные) клетки, их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах или на телевизионном экране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных выше объектов.

Изучение клеток in vitro – это один из подходов, позволивших получить много цепных сведений о клетках. Заключается в том, чтобы выделять клетки из определенных частей организма и выращивать их в, так называемых, клеточных культурах, где их можно подробно изучать с помощью микроскопии и других методов. В клеточных культурах клетки могут делиться, перемещаться, вырабатывать различные вещества и выполнять многие из тех функций, которые бы они выполняли в организме. Используя методы микрохирургии, можно также производить операции на клетках in vitro, например, пересаживать ядро от одной клетки другой. Одна из многих целей, для достижения которых используют метод культуры клеток, это определение истинного пола спортсмена или больного. Другая задача – определение степени токсичности того или иного вещества для живых клеток. Культуры клеток широко используются для изучения специализации клеток и их злокачественного перерождения и, наконец, это единственный этически приемлемый способ проведения экспериментов на человеческих тканях.

Важное преимущество изучения клеток in vitro состоит в том, что этот метод даёт возможность проводить наблюдения в строго контролируемых условиях среды, которые имитируют среду организма, но вместе с тем позволяют избежать тех сложных и изменчивых влияний, которым, как известно, клетки подвергаются внутри организма. Данный метод обладает, однако, одним недостатком: при удалении клеток из их естественной среды они утрачивают взаимосвязи, существующие между отдельными клетками в ткани. Поскольку любой перенос в новую и притом искусственную среду не может не оказывать влияния на организацию и функции клеток, не всегда ясно, в какой мере некоторые данные, полученные in vitro, могут служить отражением тех процессов, которые действительно происходят в организме.

Изучение клеток на гистологических срезах.

Метод состоит в изготовлении чрезвычайно тонких срезов тканей, которые после специальной обработки можно исследовать с помощью светового или электронного

микроскопа. Поскольку такой метод позволяет изучать только мертвые клетки, на первый взгляд он кажется совершенно неподходящим для изучения живых клеток. Однако с его помощью можно сохранять структурные взаимоотношения, существующие между клетками в тканях и изучать части тела в разном возрасте и согласно различной функциональной активности.

Световая микроскопия.

Подробное устройство светового микроскопа изучается на кафедре биологической и медицинской физики. Общий вид светового микроскопа показан на рис.1.

Рис. 1. Устройство светового микроскопа.

1 – основание штатива; 2 – колонка штатива; 3 – головка тубусодержателя; 4 – тубус; 5 – окуляр; 6 – револьверная система; 7 – объективы; 8 – столик микроскопа; 9 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 10 – винт конденсора; 11 макрометрический винт; 12 – микрометрический винт; 13 – зеркало.

Световая микроскопия подразделяется на стандартную световую микроскопию и специальные методы световой микроскопии. В обоих случаях световой поток, проходя через конденсор микроскопа, концентрируется, далее проходит через гистопрепарат, изменяясь за счет различных преломлений гисто – структур препарата. Затем пучок света идет через объектив, в котором формируется изображение.

Далее изображение увеличивается системой линз окуляра, после чего воспринимается глазом (рис.2).

Рис. 2. Схема светового микроскопа и ход светового потока в его оптической системе;

Любой микроскоп имеет два основных показателя, характеризующих его возможности.

1. Общее увеличение микроскопа – соотношение между линейными размерами полученного в микроскопе изображения объекта и истинными размерами этого объекта. Она определяется, как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра микроскопа. Общее увеличение светового микроскопа может теоретически достигать 2500 раз, но полезное увеличение, т.е. увеличение позволяющие выявить детали строения гистологического объекта, составляет не более 1500 раз.

2. Разрешающая способность – наименьшее расстояние между двумя точками объекта, на котором они видны раздельно.

Разрешающая способность является более важным показателем микроскопа, чем его увеличение. Повышая разрешающую способность, т.е. уменьшая расстояния раздельного восприятия двух точек гистологического объекта, исследователь будет видеть все более мелкие детали. Разрешающая способность микроскопа определяется по формуле:

d = /2,

где d – расстояние раздельного видения точек объекта;– длина волны.

Из формулы следует, что для повышения разрешающей способности микроскопа нужно использовать источник света с очень малой длиной волны. Это подтолкнуло учёных к поиску способов увеличить разрешающую (ультрафиолетовая и люминесцентная микроскопия), а также к открытию электронного микроскопа, в котором вместо света стали использовать пучок электронов, имеющий очень короткую длину волны.

Виды световой микроскопии.

1. Стандартный световой микроскоп.

В стандартном световом микроскопе для просвечивания гистологических объектов используется видимая часть спектра света. Длина её волны в среднем равна 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа равна примерно 0,2 мкм, а его общее увеличение составляет около 2500 раз (полезное – 1500 раз).

2. Ультрафиолетовая микроскопия.

В данном случае для просвечивания объекта используется ультрафиолетовая часть спектра, имеющая длину волны 0,2 мкм. Таким образом, разрешающая способность этого микроскопа равна 0,1 мкм, что в 2 раза выше, чем у обычного микроскопа. Так как полученное изображение невидимо для глаза, то оно регистрируется на фотопластинке или люминесцентном экране.

3. Люминесцентная микроскопия.

Это метод микроскопии, в котором используется явление люминесценции, или свечения некоторых веществ при воздействии на них коротковолновых лучей. Поглощая коротковолновое излучение, молекулы этих веществ переходят в возбуждённое состояние и сами начинают излучать свет, который имеет длину волны большую, чем длина волны возбуждающего света. Такой свет и регистрируется в люминесцентном микроскопе. Коротковолновое излучение и свет люминесценции разделяются при помощи светофильтров.

Различают аутолюминесценцию и наведенную люминесценцию. При аутолюминесценции гистологический объект испускает свет люминесценции без предварительной обработки. Любая клетка живого организма обладает собственной люминесценцией, которая, однако, в большинстве случаев очень слабая и трудно регистрируется. При наведенной люминесценции объект обрабатывается специальными люминесцирующими красителями, которые связываются с клетками и тканями организма,

делая их видимыми. Примером такого красителя является акридиновый оранжевый. Он достаточно прочно связывает с нуклеиновыми кислотами и вызывает красное свечение РНК и зеленое ДНК. В комплект современных люминесцентных микроскопов включаются фотометрические насадки, позволяющие измерять интенсивность люминесценции, что дает возможность количественного определения связывающего люминесценцирующий краситель вещества.

4. Интерференционная микроскопия.

Винтерференционном микроскопе падающий на объект световой поток раздваивается. При этом одна его часть идет на объект, а другая – минуя его. Затем два пучка вновь соединяются и при этом возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно определить точную концентрацию вещества в клетке. Таким образом, интерференционный микроскоп также позволяет осуществлять количественные морфологические исследования.

5. Поляризационная микроскопия

Вмикроскопах этого типа световой пучок при помощи специальных призм (призмы Николя) различается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры со строгой ориентацией молекул, световые лучи запаздывают относительно друг друга в результате неодинакового их преломления. Далее пучок света пропускается через анализатор, который определяет – степень отклонения поляризации света при прохождении через объект. Это позволяет определить характер расположения молекул, например, в миофибриллах, а также наблюдать спиральные или невидимые при других методах исследования структуры.

6. Фазовая – контрастная микроскопия

Это метод изучения клеток в световом микроскопе, который имеет фазовоконтрастное устройство. В нем использован принцип неодинакового изменения фаз световых лучей при прохождении их через разные по плотности структуры изучаемого объекта (рис 3.). При этом происходит смещение фаз световых волн, что приводит к повышению контрастности структур объекта и позволяет рассматривать неокрашенные и живые клетки. Разновидностью фазово-контрастного микроскопа является темно-польный микроскоп, который дает негативное изображение по сравнению с позитивным фазовоконтрастным изображением

Рис. 3. Оптическая система фазового-контрастного микроскопа.

1 – отклоненный свет, 2 – неотклоненный свет, 3 – плоскость изображения (освещена неотклоненным светом, сдвинутым по фазе), 4 – кольцевая апертура (фазовое кольцо), 5 – плоскость объекта, 6 – объектив, 7 – фазовая пластинка, 8 – интерференция.

Электронная микроскопия и ее виды.

Электронная микроскопия используется для «просвечивания» морфологических объектов пучком электронов. Пучок электронов испускается электронной пушкой в условиях высокого вакуума и ускоряющего напряжения. Далее этот пучок фокусируется

при помощи электромагнитов (электромагнитные линзы). Сфокусированный пучок направляется на изучаемый объект, имеющий структуры с различной электронной плотностью. Пройдя через объект, пучок электронов падает на люминесцирующий экран, на котором и создает плоскостное изображение структур объекта. Это изображение может быть сфотографировано. Общий вид электронного микроскопа показан на рис. 4.

Рис. 4. Общий вид (а) и схема (б) электронного микроскопа 1 – высоковольтный кабель, 2 – электронная пушка, 3 – анод, 4 – первая конденсорная

линза, 5 – вторая конденсорная линза, 6 – ручка юстировки пушки, 7 – механизм диафрагмы конденсора, 8 – держатель образца, 9 – камера образца, 10 – механизм аппертурной диафрагмы, 11 – механизм селекторной

200000 раз выше, чем световых микроскопов), а увеличение – 1 миллион раз. Описанная разновидность электронной микроскопии называется просвечивающей (трансмиссионной). Используя ее, можно изучить тонкое внутреннее строение клеток и межклеточных структур.

Сканирующие, или растровые, микроскопы позволяют увидеть трехмерное изображение объекта, его поверхность. Принцип работы растрового электронного микроскопа заключается в том, что пучок электронов последовательно движется по поверхности гистологического объекта, на которую предварительно напылено твердое

регистрируются телевизионным экраном.

Так, последовательно «высвечивается» (сканируется) вся поверхность гистологического объекта. Рисунок 5 демонстрирует изображения объектов, получаемых с помощью трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов.

Рис. 5. Изображения гистологических объектов, получаемые при помощи трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов, а – трансмиссионная микроскопия. Видно тонкое строение клеток и межклеточного вещества;

б, в – сканирующая микроскопия: видны детали поверхности клеток и межклеточных

движения электронов. Благодаря этому они значительно глубже, чем при обычной трансмиссионной микроскопии, проникают в изучаемый объект.

Высоковольтный микроскоп дает высокую разрешающую способность и позволяет изучать срезы толщиной до нескольких микрометров.

Гистохимия.

В основе гистохимических методов исследования лежит использование химических реакций для изучения различных химических компонентов клеток и тканей. Современные гистохимические методы позволяют выявлять в клетках аминокислоты, белки, жиры, углеводы, минеральные вещества и другие продукты. Принцип гистохимических реакций состоит в том, что используются красители, которые избирательно связываются только с теми химическими соединениями клетки, которые