6 курс / Гастроэнтерология / Актуальные_вопросы_хирургической_гепатологии,_гастроэнтерологии

И. И. Дементьева, Ю. А. Морозов, М. А. Чарная, В. Г. Гладышева, А. В. Гончарова

Система гемостаза реципиента при трансплантации доли печени от родственного донора

Российский научный центр хирургии имени акад. Б.В.Петровского РАМН, г. Москва

Введение. Выраженные нарушения гемостаза на фоне терминальной стадии печеночной недостаточности, являются одной из основных причин повышенной кровоточивости и увеличения ранней летальности после ортотопической трансплантации печени (ОТП) [6].

Цель работы: изучить изменения системы гемостаза у реципиента при трансплантации доли печени от родственного донора на этапах хирургического лечения.

Материалы и методы. Обследовано 15 реципиентов, которым выполнена трансплантация доли печени от родственного донора. Все больные имели терминальную стадию печеночной недостаточности, вызванную циррозом печени.

Изучали коагуляционный гемостаз – тромбиновое время (ТВ), сек, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), сек, протромбиновое время (МНО), концентрацию фибриногена (Фг), г/л, активность фактора XIII, %; тромбоцитарный гемостаз – количество тромбоцитов тыс/мкл, АДФ-индуцированную агрегацию, %; систему естественных антикоагулянтов – активность антитромбина III(АТ III), % и протеина С, НО; фибринолиз – время XIIa-калликреин-зависимого фибринолиза (XIIaКЗФ), сек, концентрации Д-димера, мг/л и растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), мг%, индекс резерва плазминогена (ИРП), %.

Исследования проводили до операции, в начале беспеченочного периода (через 15 минут после начала веновенозного обхода), через 15 минут после пуска кровотока через трансплантат, в конце операции, на 1. 3 и 7 сутки после операции.

Статистическая обработка результатов выполнена с применением непараметрических методов вариационной статистики. Различия считали достоверными при р<0,05. Результаты представлены как M±σ.

Результаты. До операции коагуляционное звено гемостаза характеризовалось относительным дефицитом факторов протромбинового комплекса (МНО 1,61±0,15; АЧТВ 41,1±3,6 сек), что обусловлено нарушением синтетической функции печени и сниженной генерацией тромбина (ТВ 15,7±1,1 сек), связанной с повышением концентрации в крови продуктов деградации Фг (РФМК до 8,4±1,5 мг%), которые обладают антитромбиновой активностью. Концентрация Фг была в пределах нормы (2,75±0,5 г/л). Одновременно отмечалось снижение активности фактора XIII(53,5±14,3%). Регистрируемая в исходе выраженная тромбоцитопения (121,8±8,5 тыс/ мкл) при нормальной агрегационной способности тромбоцитов (51,0±19,3%) была обусловлена явлениями гиперспленизма на фоне портальной гипертензии. Система естественных антикоагулянтов характеризовалась снижением активности АТ IIIдо 66,5±3,5% и протеина С до 0,79±0,10 НО. У 55% больных отмечалась активации XIIaКЗФ, тогда как его торможение наблюдалось только в 18% случаев. При этом уровень Д-димера не превышал нормальных значений (0,20±0,06 мг/л), однако концентрация РФМК была повышена в 2 раза

(8,4±1,5 мг%). ИРП был в пределах нормы (100,2±8,0%).

Вначале беспеченочного периода отмечались нормализация МНО до 1,30±0,09, удлинение АЧТВ до 84,0±18,4 сек, обусловленное гепаринизацией при проведении вено-венозного обхода. Количество тромбоцитов значимо не изменялось (122,1±10,0 тыс/мкл), у 50% больных отмечалась их гипер-, а у 50% - гипоагрегация. В этот период число пациентов с гиперфибринолизом оставалось прежним (57%). Уровни Д-димера и РФМК имели тенденцию к увеличению на фоне снижения ИРП до 79,0±9,3%.

После пуска кровотока регистрировалось повышение МНО до 1,60±0,2 и снижение концентрации Фг до 1,97±0,15 г/л. Эти изменения сохранялись до конца операции. Хотя число тромбоцитов в среднем увеличивалось до 192,0±12,7 тыс/мкл, но их агрегационная способность умеренно снижалась (до 38,4±5,9%). На этом этапе активация фибринолиза отмечалась у всех пациентов на фоне дальнейшего повышения содержания Д-димера и РФМК, что, по-видимому, обусловлено изменениями внутрипеченочной гемодинамики с выбросом активаторов фибринолиза. При этом ИРП увеличивался до 100,0±9,3%.

Вконце операции количество тромбоцитов несколько снижалось до 141,3±13,6 тыс/мкл, их агрегационная способность не изменялась (39,1±7,3%). Гиперфибринолиз выявлялся лишь у 30% больных, тогда как у остальных пациентов отмечалась нормальная активность XIIaКЗФ при неизменном содержании Д-димера и РФМК и дальнейшим незначимым увеличением ИРП (107,4±10,2%).

Активности АТ IIIи протеина С оставались сниженными на протяжении всей операции, на 1 сутки после операции отмечалось их увеличение практически до нормальных значений (84,8±5,0% и 0,97±0,12 НО, соответственно), что сохранялось и в последующем. Динамика этих показателей отражала, по нашему мнению, восстановление синтетической функции трансплантата.

На 1 сутки после операции отмечалась нормализация МНО (1,44±0,14) и АЧТВ (38,3±5,3 сек), усиление генерации тромбина (ТВ 10,9±0,6 сек). Концентрация Фг не изменялась (2,01±0,07 г/л). У 75% больных сохранялась умереная тромбоцитопения (159,6±13,2 тыс/мкл) при нормальной агрегационной способности (45,3±8,1%). У 70% больных регистрировалась депрессия фибринолитической активности за счет истощения пула активаторов (ИРП 88,2±7,5%). Одновременно наблюдали повышение уровня Д-димера до 0,70±0,06 мг/л и РФМК до 15,7±2,3 мг%. Данное обстоятельство могло быть обусловлено пониженной активностью фактора XIII(72,9±5,9%).

На 3-7 сутки после операции сохранялась усиленная генерация тромбина. Дальнейшее уменьшение МНО (1,33- 1,20) свидетельствовало о нормальном функционировании трансплантата. На 3 сутки отмечалось повышение концентрации Фг до 3,1±0,4 г/л, а на 7 сутки – снижение до 2,05±0,08 г/л.

124

К 3 суткам после операции выраженность тромбоцитопении усиливалась у всех пациентов (110,4±7,4 тыс/мкл) за счет потребления тромбоцитов со одновременным снижением их функции до 34,3±5,2%. Эта картина сохранялась и на 7 сутки после операции (123,3 ±5,5 тыс/мкл и 35,3±5,6%, соответственно).

На 3-7 сутки после операции депрессия фибринолиза на фоне незначительного увеличения ИРП наблюдалась практически у всех больных. Содержание Д-димера увеличивалось до 1,1±0,3 мг/л, в то время как уровень РФМК практическинеизменялся.РезкоеувеличениеколичестваД-димерадо2,3±0,5мг/лк7суткамсвязано,по-видимому, с сохраняющимся дефицитом активности фактора XIII.

Обсуждение. У большинства пациентов с хронической печеночной недостаточностью в предоперационном периоде регистрируются глубокие изменения систем коагуляции и фибринолиза, отмечается снижение как числа так и функции тромбоцитов [10].

Снижение концентрации плазменных факторов II, V, VII, IX-XII составляет 35-45% [3].

По данным Carr J.(1989) активация фибринолиза наблюдалась у 15% больных с хронической печеночной недостаточностью [1], тогда как по нашим данным гиперфибринолиз регистрировался у 55% реципиентов.

У реципиентов отмечалось значительное (в 2 раза) повышение ПДФ, что дает основание предполагать наличие хронического ДВС-синдрома [4].

До начала беспеченочного периода коагуляционный профиль отражает в основном характер и тяжесть исходной патологии печени, поэтому существенной динамики в показателях не отмечалось [7].

Вбольшинстве исследований выявлялось умеренное снижение концентраций факторов свертывания и уменьшение количества тромбоцитов на 60-65 %. Однако, по нашим данным число тромбоцитов на этом этапе значимо не изменялось.

Наблюдаемое рядом авторов усиление фибринолитической активности у 10-20% реципиентов [7, 8], позволяет предположить возможность развития первичного гиперфибринолиза. Наши результаты позволяют присоединиться

кмнению Palareti G. и соавт. (1991), которые указывают на наличие другого механизма коагулопатии – вторичного гиперфибринолиза [8].

Беспеченочный период рассматривается большинством исследователей как этап, характеризующийся прогрессированием, формированием и развитием разнообразных изменений систем коагуляции и фибринолиза [5, 7]. Беспеченочная фаза операции характеризовалась выраженным усилением фибринолитической активности, протекающим на фоне продолжающегося потребления факторов свертывания, дефицита антитромботического потенциала, тромбоцитопении. Выявленные патологические процессы способны активно влиять на процессы коагуляции в последующие периоды [5].

Втечение реперфузионной фазы операции на фоне уже имеющейся патологии гемостаза возможно развитие новых самостоятельных механизмов нарушения гемокоагуляции, что обусловлено включением в кровоток донорской печени [9].

Втечение этого периода операции в ряде работ отмечено прогрессивное снижение уровня факторов свертывания, повышение содержания продуктов деградации Фг, тромбоцитопения, что интерпретировалось как проявление коагулопатии потребления, развивающейся при реперфузии трансплантата.

Harper P. и соавт. (1989) отмечали снижение концентрации Фг и повышение уровня ПДФ [2], что согласуется с результатами нашего исследования. Lewis J. и соавт. (1989) не обнаружили падения уровня тромбоцитов и Фг, более того, они выявили рост их концентраций [6].

Если KangY. и соавт. (1989) сообщают, что у 40% больных на этом этапе регистрировался гиперфибринолиз [4], по нашим данным активация фибринолиза наблюдалась у всех реципиентов. Нами было установлено, что увеличение активности АТ III и протеина С, нормализация МНО на 1-ые сутки после операции свидетельствовали о восстановлении синтетической функции трансплантата, а продолжающийся рост уровня Д-димера вплоть до 7-х суток послеоперационного периода при истощении пула естественных активаторов фибринолиза связан с сохраняющимся дефицитом фактора XIII.

Выводы.

1.Исходный относительный дефицит факторов протромбинового комплекса и сниженная активность естественных антикоагулянтов у реципиентов при трансплантации доли печени от родственного донора связаны с нарушениями синтетической функции печени; выраженная тромбоцитопения при их нормальной агрегационной способности обусловлена явлениями гиперспленизма на фоне портальной гипертензии.

2.После пуска кровотока по трансплантату у всех пациентов отмечалась активация фибринолиза на фоне повы- шениясодержанияД-димераиРФМК,чтообусловленоизменениямивнутрипеченочнойгемодинамикисвыбросом активаторов фибринолиза.

3.Послеоперационная динамика показателей системы естественных антикоагулянтов и МНО отражает восстановление синтетической функции трансплантата.

4.Резкое увеличение количества Д-димера к 7 суткам связано не с активацией фибринолиза, а с сохраняющимся дефицитом активности фактора XIII.

Список литературы:

1.Carr J. Disseminated intravascular coagulation in cirrhosis. // Hepatology. – 1989. – vol. 10. – p. 103

2.Harper P., Luddington R., Jannings A. et al. Coagulations changes following hepatic revascularization during liver transplantation. // Transplantation. – 1989. – vol. 48(4). – p. 603-607

3.Hersch S., Kunelis T., Francis R. The pathogenesis of accelerated fibrinolysis in liver cirrhosis: A critical role for tissue plasminogen activator inhibitor. // Blood. – 1987. – vol. 69. – p. 1315

4.Kang Y., Borland L., Piccone J. Intraoperative coagulation changes in children undrgoing liver transplantation. // Anesthesiology. – 1989. – vol. 71. – p. 44

125

5.Lattuada A., Mannucci PM., Chen C. et al. Transfusion requirements are correlated with the degree of proteolysis of von Willebrand factor during orthtopic liver transplantation. // Thromb. Haemost. – 1997. – vol. 78(2). – p. 813-819;

6.Lewis J., Bontempo F., Anad S. et al. Liver transplantation: intraoperative changes in coagulation factors in 100 first transplants. // Hepatology. – 1989. – vol. 9(2). – p. 710-714

7.Palareti G., Legnani C., Maccaferri M. et al. Coagulation and fibrinolysis in opthotopic liver transplantation: role of the recipients disease and use of antithrombin III concentrates. // Hemostasis. – 1991. – vol. 21. – p. 68-76;

8.PaulsenW.,AnesM.,WhittenC.Considerationsforanestheticmanagementduringveno-venousbypassinadulthepatictransplantation. //Aesth.Analg. – 1989. – vol. 68. –p. 489

9.Takasu S., Sakagami K., Oiwa T. et al. Correlation between microvascular damage and hepatic dearens in ewine liver transplantation. // Transplantation Proceedings. – 1991. – vol. 23(1). – p. 707-710

10.Xiu D., Zhang T., Yuan J., Song S. et al.Analysis of the correlated factors of the early mortality after orthotopic liver transplantation. // Beijing Da Xue Xue Bao. – 2003. – vol. 35(3). – p. 314-316.

Т. Ф. Федорова1, О. В. Зуева1, Л. Р. Тарковская2, О. А. Смирнова2, Е. А. Хаит2, О. Ю. Матвиенко2

Внутрисосудистая активация тромбоцитов у больных гепатоцеребральной дистрофией

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова, г. Санкт-Петербург1, ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» ФМБА, г. Санкт-Петербург2

Введение. Гепатоцеребральная дистрофия (Болезнь Вильсона-Коновалова) – наследственное заболевание, обусловленное нарушением метаболизма меди в организме, приводящее к избыточному накоплению и токсическим эффектам меди в органах мишенях. Поражение печени при гепатоцеребральной дистрофии (ГЦД) является первичным патогенетическим звеном, в большинстве случаев протекает по типу латентного хронического гепатита, с последующей трансформацией в цирроз и развитием таких грозных осложнений, как портальная гипертензия и геморрагический синдром. Симптомы поражения головного мозга могут присоединяться к печеночной патологии на различных сроках заболевания [2,5,12]. В генезе геморрагических проявлений при ГЦД основное внимание уделяется дисфункции плазменно-коагуляционного гемостаза и тромбоцитопении [2,12]. Между тем, при многих болезнях печени выявляются не только количественные, но и значимые качественные нарушения кровяных пластинок: их адгезивно-агрегационной и секреторной способности [3,7,11].

ЦельисследованиясостоялавизучениивнутрисосудистойактивациииагрегациитромбоцитовубольныхГЦД. Материалы и методы исследования. Обследовано 58 человек (31 мужчина и 27 женщин) больных ГЦД, в возрасте от 17 до 54 лет (средний возраст 29±10,0 лет), из них у 22 человек исследования проводились до начала патогенетической терапии (диагноз ГЦД установлен впервые), у 36 – на фоне терапии в различные сроки заболевания. Из 22 человек с первично установленным диагнозом у 12 исследование проведено в динамике на фоне применения патогенетической терапии. На основании данных обследования у 18 больных наблюдалась висцеральная, у 40 – неврологическая стадии заболевания. Вильсоновское поражение печени (гепатит) без признаков портальной гипертензии, гиперспленизма и снижения белково-синтетической функции печени диагностировано у 10 человек с висцеральной стадией заболевания (группа №1) и у 9 человек с неврологической стадией (группа №3), поражение печени с признаками портальной гипертензии, гиперспленизмом и снижением белково-синтетической функции печени – у 8 человек с висцеральной стадией заболевания (группа №2) и у 31 человека с неврологической стадией

(группа №4). Контрольную группу составили 25 здоровых человек (средний возраст 35±13 лет). Внутрисосудистую активацию тромбоцитов (ВАТ) определяли по методу А.С. Шитиковой с использованием

фазово-констрастного микроскопа (методические рекомендации № 94/8, СПб, 1996 г.).

Статистический анализ выполнен с помощью компьютерных программ SPSS (применялся t-критерий Стьюдента). Результаты исследования показателей внутрисосудистой активации тромбоцитов у больных ГЦД представлены в таблице 1. У всех больных ГЦД по сравнению с контролем выявлено снижение в крови числа тромбоцитов, при этом отмечалось существенное повышение показателей ВАТ: суммы активных форм тромбоцитов (САФТ) и числа тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты (ЧТвА). Достоверное, по сравнению с контролем, снижение количества тромбоцитов выявлено при обеих стадиях заболевания. Однако более выраженная тромбоцитопения была характерна для больных групп №2 и №4, и вероятно, обусловлена тяжестью поражения печени. При висцеральной и неврологическойстадииразличиепоколичествубольныхстяжелымипоражениямипечени(группы№1+3и№2+4)

достоверно, X2 = 8,8 при р=0,005.

Таблица 1. Показатели внутрисосудистой активации тромбоцитов у больных гепатоцеребральной дистрофией (M±σ)

Примечание. Достоверные различия: 1 (p<0,05), 2 (p<0,001) – с контролем; 3 (p<0,05) – между разными группами одной стадии заболевания.

126

Тяжестьзаболеванияистепеньпораженияпеченибылизначимылишьдляконцентрациитромбоцитов,нонепоказателей ВАТ. Хотя повышение ВАТ по сравнению с контролем выявлено во всех исследуемых группах больных, достоверных отличий ВАТ внутри групп сравнения не обнаружено. На показатели ВАТ у больных ГЦД значимо не влияла тяжесть цитолиза, а также уровень билирубина и щелочной фосфатазы (р<0,05). На фоне эффективной патогенетической терапии ожидаемое улучшение показателей внутри­сосудистой активации тромбоцитов у больных ГЦД не наблюдалось (таб. 2).

Таблица 2. Динамика показателей внутрисосудистой активации тромбоцитов у больных гепатоцеребральной дистрофией на фоне патогенетической медьэлиминирующей терапии (M±σ)

Примечание. Достоверные различия: 1 (p<0,01) – с контролем.

Обсуждение. Изполученныхданныхследует,чтоприГЦДнаблюдаетсяактивациятромбоцитарногозвенагемостаза на фоне умеренной тромбоцитопении.

Аналогичные изменения морфофункциональных свойств тромбоцитов выявляются у больных с хроническими гепатитами и циррозами вирусного и/или алкогольного генеза, при этом отмечается прямая зависимость увеличения внутрисосудистой активации кровяных пластинок от тяжести цитолиза, мезенхимального воспаления, а также уровня репликации вируса и степени фиброза [3,7,11].

Тромбоцитопения, развивающаяся при хронических поражениях печени, вызвана уменьшением образования тромбоцитопоэтина, повышенной секвестрацией тромбоцитов в селезенке, а также потреблением их при диссеминированном внутрисосудистом свертывании, которое нередко осложняет течение цирроза печени [8,10,11].

Внашем случае тяжесть заболевания и степень поражения печени были значимы лишь для концентрации тромбоцитов, но не показателей ВАТ. ГЦД одно из немногих наследственных заболеваний, при котором разработаны методы патогенетического лечения.

Своевременнаяи адекватная терапия медьэлиминирующими препаратамиприводит к стойкомурегрессу (полному или частичному) неврологической симптоматики, гепатоспленомегалии и портальной гипертензии, цитолитического, холестатического и мезенхимально-воспалительного синдромов, восстановлению белково-синтетической функции печени [2,5,12].

Отсутствие у обследованных нами больных достоверных отличий ВАТ внутри групп сравнения, а также значимой динамики показателей ВАТ на фоне эффективной патогенетической терапии дает основание предполагать наличие дополнительных факторов, изменяющих свойства тромбоцитов.

Одним из таких специфичных для ГЦД факторов может быть падение в крови уровня церулоплазмина (ЦП), вследствие, нарушения его синтеза в печени и, возможного влияния патогенетической терапии [2,5].

Так, в экспериментальных работах Ермолаевой Е. Н. и соавт. было показано, что в условиях in vitro ЦП снижает адгезивно-агрегационную способность и реакцию высвобождения кровяных пластинок, а in vivo, кроме того, увеличивает количество тромбоцитов в крови [1].

ВозможныммеханизмомдействияЦПявляетсяингибирующеевлияниеегокакантиоксидантанаинтенсивность процессов свободнорадикального окисления в клетках крови и в плазме [1,2].

ПомимоЦП,приГЦДвыявляетсяснижениеидругихкомпонентовантиоксиданостнойзащиты[2,13].Смещение соотношения антиоксидантной и прооксидантной систем в сторону последней приводит к формированию окислительного стресса, основного механизма токсического действия меди [6,9].

Модификация белков клеточных мембран при окислительном стрессе [9] может изменять поверхностный заряд эндотелиоцитов сосудистой стенки и (или) тромбоцитов, вызывая реакции активации, адгезии и агрегации. Так Самаль А.Б. и соавт. показали, что тромбоциты в условиях окислительного стресса, вызванного малыми дозами гидропероксида in vitro, могут активироваться с последующей их агрегацией [4].

Помимо этого, на активацию тромбоцитов и нарушение гемостатических реакций при ГЦД может влиять хронический и или острый внутрисосудистый гемолиз [5,12].

Всвете этого представляется закономерным заключение о том, что нарушение обмена меди, усиление процессов свободнорадикального окисления и истощение эндогенных антиоксидантов при ГЦД могут быть факторами, способствующими развитию количественных и качественных нарушений тромбоцитов.

Активация тромбоцитов на определенном этапе заболевания может в какой-то степени компенсироваться отклонениями в коагуляционном звене гемостаза (усиление фибринолитической активности и снижение синтеза в печени витамин К-зависмых факторов свертывания), что существенно сужает возможности адаптации.

127

Между тем, нарушения морфофункциональных свойств тромбоцитов и связанные с ними расстройства микроциркуляции способствуют тяжелому течению хронических заболеваний печени [7,10] и нуждаются в медикаментозной коррекции.

Выводы.

1.Для больных ГЦД характерна активация тромбоцитарного звена гемостаза.

2.На фоне патогенетического лечения медьхелатирующими препаратами у больных ГЦД сохраняется внутрисосудистая гиперактивация тромбоцитов, что необходимо учитывать в симптоматической терапии.

Список литературы:

1.Ермолаева Е. Н. Влияние церулоплазмина на функциональное состояние тромбоцитов при экспериментальных нарушениях гемостаза. //Автореф. дисс… канд.мед.наук.Челябинск, 2003. 20 с.

2.Лекарь П. Г. Гепатоцеребральная дистрофия/ Лекарь П. Г., Макарова В. А. Л. 1984. 206 с.

3.Ламбакахар М. Г. Особенности патогенетических механизмов нарушения гемостаза у больных циррозом печени. //Автореф. дисс… канд.мед.наук.-СПб, 1999. С.9 -12.

4.Самаль А. Б. Н2О2-индуцированная агрегация и дезагрегация тромбоцитов / Самаль А. Б., Черенкевич С. Н., Хмара Н. Ф. // Гематол. и трансфузиол. 1988. Т.32. №11. С.34-37.

5.Экстрапирамидные расстройства: Руководство по диагностике и лечению /Под ред. В. Н. Штока, И. А. Ивановой-Смоленской,

О.С.Левина. М., 2002. С.495-502.

6.Ткачев С. В. Роль окислительного стресса в механизме токсического действия фунгицидной композиции на основе солей меди и цинка//Белорусский медицинский журнал. 2004. №1. С. 84-86.

7.Ягода А. В. Функциональная активность тромбоцитов при хронических вирусных заболеваниях печени /Ягода А. В., Корой П. В., Касторная И. В.//РЖГГН. 2004. №2. С.29-33.

8.AdinolfiL.E.Hepaticfibrosisacentralroleinthepathogenesisofthrombocytopeniainpatientswithchronicalvirialhepatitis/Adinolfi L. E., Giordano M. G.AndreanaA. et al.//J. Haematol. 2001.Vol.113 (3). P.590-595.

9.Gaetke L. M., Chow C. K. Copper toxicity, oxidative stress and antioxidant nutrients. Toxicology/Gaetke L. M., Chow C. K./ - 2003. Vol. 189. P. 147 – 163.

10.Papatheodoridis G. Thrombotic risk factors and extent of liver fibrosis in patients with chronical virial hepatitis/ Papatheodoridis G., Papakonstantinou E.,Andrioti E. et al. //J. Hepatol. 2002. Vol. 36. P.36-175.

11.Peck-Radosauljevic M. Is inadequate thrombopoetin production a major cause of thrombocytopenia in cirrosis of the liver? / PeckRadosauljevic M., Zacherl J., MengY.G. et al. //J. Hepatol. 1997. Vol. 22(1). P. 127-131.

12.Roberts E.A., Schilsky M. L.Apractice guideline on Wilson disease //J. Hepatol. 2003. Vol. 37(6). P. 1475-1492.

13.Robert S. Genetic hemochromatosis and Wilson'S disease: Role for oxidant stress?/ Robert S. Britton, Kyle E. Brown. //J. Hepatol.

1995. Vol.21 (4). Р. 1195-1197.

А. К. Мартусевич, Ж. Г. Симонова, Н. Ф. Камакин

Экспериментальное моделирование «поведения» слюны и желчи человека при дегидратации в различных условиях

ГБОУ ВПО Кировская ГМА Минздравсоцразвития России, г. Киров, ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»

Минздравсоцразвития России, г. Нижний Новгород

Введение. В настоящее время работы, касающиеся рассмотрения кристаллообразования биологических жидкостей организма человека, имеют преимущественно диагностическую направленность, тогда как значимость влияния внешних и внутренних факторов на кристаллогенные и инициирующие свойства биологических субстратов практически не изучена [1, 3].

Целью исследования являлось экспериментальное изучение «поведение» биологического материала при его дегидратации на стекле.

Материал и методы исследования. Методом тезиокристаллоскопического анализа изучен характер свободного и инициированного кристаллогенеза 125 высушенных образцов слюны [4], полученных от 95 практически здоровых людей. Также произведено исследование кристаллогенной активности образцов нативной желчи практически здоровых людей с применением методики классической кристаллоскопии.

Анализ результатов кристаллообразования слюны и желчи осуществляли морфологически (по выявлению особенностей картины) и визуаметрически (с помощью собственной системы полуколичественных параметров). Фации биожидкости фиксировались цифровой фототехникой при увеличении микроскопа х56.

Для оценки воздействия нескольких факторов на кристаллизацию биологической среды использован дисперсионный анализ (ANOVA).

РасчетывыполнялисьвтаблицахMicrosoftExcel2003,спомощьюпакетовPrimerofbiostatistics4.03иSPSS11.0.

Результаты и их обсуждение. В настоящее время установлены некоторые закономерности реагирования кристаллов биологического происхождения на различные воздействия [1, 2, 5].

В большинстве случаев специалисты ограничиваются исследованиями, проводимыми in vitro (на стекле), но эти результаты могут быть экстраполированы на жидкие среды человека [1, 3, 4]. Несмотря на имеющуюся достаточно большую теоретическую базу [1-3, 5], лишь единичные исследования посвящены проблеме моделирования жидкокристаллических состояний in vivo путем применения анализа in vitro, что трактуется нами как экспериментальная биокристалломика [4]. В оценке результатов «свободного» и инициированного кристаллогенеза превалирующую роль играет комплекс условий проведения дегидратации, обобщенный нами в виде схемы (рис. 1). Они существенны, прежде всего, в детерминации тезиграфической фации, хотя являются значимыми и для свободной кристал-

128

лизации слюны. Эти условия направлены на стабилизацию биожидкости в форме фации с сохранением ее информационной емкости и в соответствии с физико-химическими и термодинамическими законами, что обусловливает особенности протекания и результата кристаллогенеза.

Нами выделены и классифицированы факторы, определяющие особенности сформированной фации анализируемого биосубстрата:

А. Внутренние факторы (микроокружение)

1.Осмотическая характеристика среды.

2.Ионный состав среды.

3.Наличие диссоциации компонентов:

А) наличие ионообразователей (преимущественно минеральных солей); Б) присутствие недиссоциирующих веществ (биологически активных, химически активных и инертных). Б. Внешние факторы (макроокружение);

1.Термические факторы;

2.Барометрическое давление;

3.Другие изменения среды (скорость потоков воздуха, влажность, присутствие в окружающей среде химически значимых соединений и т.д.).

Рисунок 1. Факторы, лимитирующие кристаллообразование биосубстратов

Вцелях изучения роли различных факторов в детерминации высушиваемого образца биологического субстрата произведено исследование значимости осмотичности и рН среды на примере фаций, приготовленных по методике дифференциальной тезиграфии с применением 5 базисных веществ (0,1%; 0,9% и 10% растворов хлорида натрия; 0,1Н раствора соляной кислоты и 0,01Н раствора гидроксида калия).

Вкачестве наиболее значимых из оцениваемых показателей микропрепарата были взяты основной тезиграфический коэффициент Q, отражающий инициаторный потенциал биоматериала, и коэффициент поясности Р, визуализирующий гетерогенность состава последнего.

С помощью многофакторного дисперсионного анализа установлено, что оба рассматриваемых фактора (осмоляльность и рН) оказывают влияние на изучаемые параметры тезиграфии (для коэффициентов Q и Р уровень достоверности составил p=0,023 и p=0,048 по сочетанию факторов). В свою очередь был произведен статистический анализданныхтезиграфиисучетомвышеописанныхпараметров.Этисведенияподтверждаютидополняютрезультаты дисперсионного анализа.

Изучение дегидратационного структурообразования желчи человека позволило установить, что в данных фациях присутствует выраженная затемненная краевая зона без дополнительных текстурных особенностей, а также обнаруживаетсяслабаякристаллогеннаяактивностьвцентральнойзоне,представленноймелкимикристаллическими

иаморфными элементами.

Вобразцах биосреды коров краевая зона занимает больший объем, в ней присутствуют многочисленные циркулярные и центростремительные разломы. Центральная зона заполнена объемными дендритными структурами с выраженной деструкцией и единичными аморфными телами. Фации желчи нутрий по морфологии краевой зоны сходны с образцами, полученными от коров, тогда как центральная зона препарата у нутрий остается практически свободной, включая лишь единичные мелкие кристаллические тела. Визуаметрия фаций желчи человека и изучаемых животных позволила верифицировать данные тенденции.

Заключение. Таким образом, в дегидратационном процессе наиболее значимы компонентный состав биосуб-

страта и факторы макроокружения (введение инициаторов кристаллогенеза, рН и осмолярность среды). Этот тезис имеет принципиальное значение с двух позиций: свидетельствует о необходимости учета факторов при проведении диагностической кристаллоскопии биосубстрата, а также косвенно указывает на возможность использования неодинакового «поведения» биожидкости для более полного извлечения ее информационной емкости.

Показано, что имеют место существенные видовые особенности кристаллогенеза желчи, причем кристаллогенная активность данной биосреды у животных выше, чем у человека, что обусловлено различием ее физикохимических свойств.

129

Список литературы:

1.БарерГ.М.Кристаллизацияротовойжидкости.Составичистотаповерхностиподложки/БарерГ.М.,ДенисовА.Б.,Михалева И. Н. с соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1998. – Т. 126, №12. – С. 693-696.

2.Бузоверя М. Э. Экспериментальное исследование влияния импульсного магнитного поля на структуру биологической жидкости /Бузоверя М. Э., Шишпор И. В., Ершкова И. А. с соавт.// Мат. III Всероссийской научно-практической конференции «Функциональная морфология биологических жидкостей». – Москва. – 2004. – С. 14-16.

3.Залесский М. Г. Конвентивные потоки в каплях воды и биологической жидкости («ЛИТОС-система») на твердой подложке / Залесский М. Г., Гетлинг А. В.// Вестник новых медицинских технологий. – 2005. – Т. XII, №3-4. – С. 43-45.

4.Мартусевич А. К. Кристаллография биологической жидкости как метод оценки ее физико-химических свойств / Мартусевич А. К., Камакин Н. Ф. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 143, №3. – С. 358-360. 5.СкопиновС.А.Влияниенизкоинтенсивноголазерногоизлучениянаформированиежидкокристаллическихструктурврастворе гликопротеидов /Скопинов С. А., Яковлева С. В., Денисова Е. А. // Молекулярная биология. – 1989. – Вып. 2. – С. 416-421.

А. К. Мартусевич, О. Б. Жданова, А. П. Русских

Кристаллогенные свойства биосубстратов при паразитозах печени (на примере фасциолеза)

ГБОУ ВПО Кировская ГМА Минздравсоцразвития России, г. Киров, ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»

Минздравсоцразвития России, г. Нижний Новгород, ГБОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия», г. Киров

Введение. Подотряд Fasciolata включает огромное количество родов и видов. Наиболее распространенными видами, имеющими важнейшее социальное, био-экологическое и экономическое значение являются F. Hepatica, F. Higantica. Помимо домашних млекопитающих, распространению фасциолеза способствуют промысловые и дикие животные, и даже такие пушные звери, как нутрии. До недавнего времени паразитологи особое внимание уделяли паразитозам сельскохозяйственных животных, не учитывая увлечение сельского населения страны содержанием нутрий на приусадебных участках.

Гельминтозыданноговидаизученыещенедостаточно,таккакнутриябылаакклиматизирована,происходилапотеря прежних видов гельминтов и их место заняли распространенные местные виды. При совместном содержании с другими животными возможна инвазия Passalurus ambiguus, Graphidium strigosum, а также T.spiralis (Конрад Й. 1984), Plagiorchis arvicolae, Gastrodiscoides Hominis, Fasciola hepatica, Fasciola gigantica , Echinococcus granulosus, Weinlandia octocoronata, Subulura hamata, Longistriata (Longistriata) maldonadoi, Longistriata (Brevispiculoides) myopotami, Gongilonema pulchrum, Ascaris sp. (А.Я. Закариев, 1967), а также Trichostrongylus columbrioformis (А.

Алтаев, 1953). Наиболее важным аспектом изучения являются антропозоонозы, которым в этом случае необходимо уделить особое внимание, так как мясо нутрии употребляется в пищу.

Наиболее часто (33,3%) при гельминтологических исследованиях обнаружены членики D. Caninum, трихоцефалез и стронгилогидоз обнаружили у нутрий в 10% и 75% случаев соответственно. Фасциолез обнаружили у 4 % нутрий, причем одна из зараженных нутрий содержалась в живом уголке в ДУ. Фасциолы – биогельминты; паразитируя в желчных ходах печени, выделяют огромное количество яиц, которые попадают в кишечник. И, как следствие, огромное количество экскрементов, которые содержат яйца фасциол, выделяются во внешнюю среду.

Все вышеперечисленное обуславливает необходимость поиска новых подходов к диагностике данного паразитоза у животных и человека, в связи с чем целью работы явилось исследование диагностических возможностей изучения характера свободного и инициированного кристаллогенеза биосубстратов при экспериментальном и спонтанном фасциолезе.

Материал и методы исследования. Кристаллогенные свойства желчи здоровых и имеющих фасциолез нутрий и коров изучали с помощью метода классической кристаллоскопии, инициаторную способностью биосреды – путем применения дифференциальной тезиграфии. Базисным веществом в тезиграфическом тесте служил 0,9% раствор хлорида натрия, не изменяющий осмолярность, рН и ионный состав биоматериала, но являющийся активным кристаллообразователем.

Описание кристаллоскопических и тезиграфических фаций осуществлялось с привлечением системы количественныхкритериев.Микропрепаратыизучалисьвтрехнеперекрывающихсяполяхзрения,вобязательномпорядке включающих все зоны образца. Верификация данных визуальной морфометрии производилась с помощью спектрометрического исследования биокристаллов на спектрофотометре PowerWave XS (Bio-Tek, USA), использовался диапазон длин волн 300-450 нм.

Статистическаяобработкаполученныхданныхосуществляласьметодамивариационнойстатистикисприменением электронных таблиц Microsoft Excel 2003, а также с использованием программых средств Primer of biostatistics 4.03.

Полученные результаты. Проведенные исследования позволили установить диагностические «паттерны» тезиокристаллоскопии желчи животных при фасциолезе. Так, на рисунках 1 и 2 приведены данные визуальной морфометрии кристаллоскопических образцов изучаемой биосреды нутрии и коровы соответственно (рис. 3 и 4).

130

Рисунок 1. Особенности свободного кристаллогенеза желчи нутрий при фасциолезе

Установлено, что наличие фасциолеза является фактором, способствующим изменению состава и физикохимических свойств желчи изученных животных, однако у представителей различных видов сдвиги носят разнонаправленный характер. В частности, у нутрий рассматриваемый паразитоз обуславливает повышение кристаллизуемости биосреды, сопровождаемое нарастанием деструктивных признаков в формируемых структурах, а также снижением доли нативных протеиновых компонентов в биологической жидкости.

У коров изменения, связанные с заражением фасциолами, проявляются в форме усиления структуризации биосубстрата с одновременным упрощением образующихся элементов. В то же время у данного вида животных выраженность деструктивных изменений формы кристаллических структур значимо не возрастает. Четкость краевой белковой зоны фации снижается в той же степени, что и у нутрий, имеющих данный паразитоз.

Рисунок 2. Классическая кристаллоскопия желчи здоровых и имеющих фасциолез коров

По большинству выявленных характеристик обнаруживаются достоверные (p<0,05) корреляционные связи высокой силы с показателями оптической плотности этих фаций.

Выводы:

1.Выявленныенормативыкристаллогенныхиинициирующихсвойствжелчимогутиспользоватьсявдиагностике паразитарных заболеваний, в том числе фасциолеза.

2.Последующие исследования морфологии других биосубстратов животных (кровь, моча, копрофильтрат) способны упростить и облегчить медицинскую и ветеринарную диагностику паразитозов.

Список литературы:

1.Белозеров С. Н. Иммунологическая диагностика гельминтозов: автореф. дисс. ... докт. вет. наук. - М., 1990. – 44с.

2.Громова И. П. Кристаллоскопический способ изучения сыворотки крови в токсиколого-гигиеническом эксперименте методом «открытая капля» // Гигиена и санитария. – 2005. – №2. – С. 66-69.

3.Мартусевич А. К., Жданова О.Б. Информативность исследования кристаллообразования при зоонозах на модели животных // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. – 2006. – №1. – С. 30-38.

4.Обухов А. А. Использование новых методов диагностики и прогнозирования в ветеринарной медицине // Сб. науч. трудов 2-й всеросс. науч.-практ. конф. «Морфология биологических жидкостей в диагностике и контроле эффективности лечения». М., 2001. – С.79-80.

5.Плаксина Г. В. Клиническое значение кристаллографического и кристаллоскопического метода исследования мочи / Плаксина Г. В., Римарчук Г. В., Бутенко С. В. с соавт.// Клиническая лабораторная диагностика. – 1999. – №10. – С. 34.

6.Martusevich A. K. Crystallodiagnostics of some animals’ helmintosis/Martusevich A. K., Grishina A. A., Bochkareva A. V. // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. – 2010. – Vol. 3, N3. – P. 176-179.

7.CapronA.Application of immunoenzyme methods in diagnosis of human parasitic diseases/ CapronA., Dugimont J.C., Fruit S. //Ann. N. -Y.Acad. Sci. - 1975. – Vol. 254. – Р. 331.

131

А. А. Косых, П. Г. Распутин, А. Ю. Зуев

Состояние клеточного иммунитета в процессе регенерации печени после резекции и иммуностимуляции

ГБОУ ВПО Кировская ГМА Минздравсоцразвития России, г. Киров

Для изучения регенерации печени в настоящее время используются многие современные методы: световая и электронная микроскопия с морфометрией, цитоспектрофотометрия, авторадиография, методы генетики и молекулярной биологии, биохимии, иммунологии и др. Благодаря использованию этих методов раскрыта морфофизиологическая основа регенерации и открылись возможности для изучения механизмов регуляции восстановительных процессов в разных органах и тканях.

Большое значение в разработке этого направления имеют исследования А.Г. Бабаевой (1, 3) по изучению системыиммуногенезаиеероливрегуляциивосстановительныхпроцессов.Оказалось,чтонарядустрофическойфункцией лимфоциты обладают еще очень важной функцией, основанной на их специфических свойствах - функцией активации клеток нелимфоидного происхождения с последующей их пролиферацией. Это свойство лимфоцитов играет важную роль в обеспечении процессов роста при регенерации и нормальном органогенезе.

Согласно полученным автором данным малые лимфоциты (Т-лимфоциты) оперированных животных в условиях адоптированного переноса побуждают не лимфоидные клетки не оперированного реципиента к делению, причем в том органе, который поврежден у оперированного донора (1, 2). Этот феномен передачи «регенерационной информации», получивший многократное подтверждение на других моделях при изучении регенерации свидетельствует об участии системы иммуногенеза в регуляции восстановительных процессов и о морфогенетической функции иммуноцитов при восстановительных морфогенезах.

Основными претендентами на роль стимуляторов клеточного деления являются Т-хелперы (CD4+), а Т-супрессоры/цитотоксические (CD8+) причастны к реализации торможения клеточного деления. В регуляции пролиферативных процессов принимают участие макрофаги (Мф) и тучные клетки (4). Их присутствие усиливает цитогенетическую активность лимфоцитов.

Известно, что на мембране Мф есть молекулы-рецепторы для активных цитокинов, вырабатываемых иммунными лимфоцитами. Через них фагоцит воспринимает сигнал от лимфоцита. Через рецепторы к фактору некроза опухолей (TNF) после связывания с лигандом Мф активируется. Через рецептор для IL-10 Мф, наоборот, инактивируется. Есть на Мф и мембранные молекулы для контактов с комплементарными мембраннымимолекулами лимфоцитов, т.е. для непосредственных межклеточных взаимодействий (CD-40, B-7, MHC-I/II). Активированные Мф продуцируют цитокины и другие биологически активные медиаторы - IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-альфа, а также простагландины, лейкотриены и др. (5).

Таким образом, исследование клеточного иммунитета в процессе регенерации печени после резекции и иммуностимуляцииявляетсяактуальнымиможетвскрытьтонкиемеханизмырегуляциивосстановительныхпроцессовворгане.

Исследования проводились на белых беспородных крысах самцах.

Частичную гепатэктомию проводили в объеме 30% ткани органа, животных выводили из эксперимента на 2, 3, 7 и 30 сутки.

Вкачестве иммуностимулятора использовали препарат «Спленопид» (6), который вводили интраперитонеально сразу после резекции печени.

Спленопидпредставляетсобойпептиднуюфракцию,выделеннуюизтканиселезенкисвинейиликрупногорогатого скота. Фармакотерапевтическая группа – иммуномодулятор, обладает иммуностимулирующим действием, активирует клеточный и гуморальный иммунитет, обеспечивая повышение специфической и неспецифической рези- стентностиорганизма.Внастоящеевремяспленопидиспользуетсявосновномвхирургиипригнойно-септических осложнениях. Имеются сведения о применении данного препарата в комплексной терапии хронического вирусного гепатита С (7).

Вткани печени с помощью морфометических методов определяли количество и объемную плотность печеночных макрофагов (клеток Купфера).

Для оценки эффективности препарата исследовалась иммунограмма крови (общее количество лимфоцитов, Т- и В- лимфоциты, 0- лимфоциты (лимфоциты, не имеющие рецепторов, характерных для Т- и В-лимфоцитов), Т- хелперы (CD4+), Т-супрессоры/цитотоксические (CD8+) и относительная масса печени (ОМ), как показатель полноты регенерации.

После резекции в печени значительно увеличивается количество мезенхимальных клеточных элементов, в основном за счет лимфоцитов и макрофагов.

Через 48 часов наблюдается выраженная макрофагальная реакция. Их количество и объемная доля увеличились более чем в 2,5 раза по сравнению с интактными животными. Увеличивается и средний объем клеток Купфера, что свидетельствует об их гипертрофии.

Реакция клеток иммунной системы на резекцию печени выразилась в относительном увеличении на 2-е и 3-и сутки количества В-лимфоцитов. Их абсолютная величина превышала норму в 1,5 - 2 раза, хотя в процентном отношении это увеличение не превышало 1,5 раза.

Через 7 суток их количество снизилось до нормальных величин, а к 30-м суткам имело вновь тенденцию к увеличению (табл. 1).

Реакция Т-лимфоцитов на резекцию печени была практически противоположной. На 2-е сутки их количество снизилось, на 3-и сутки превысило норму, к 7 суткам увеличилось в 2 раза по сравнению с нормой, в процентном отношении это увеличение составило 38% (Р˂0,05), а к 30 суткам не отличалось от нормы.

132

Среди Т-лимфоцитов наиболее значительное увеличение было Т-хелперов на 3 и 7 сутки (в 1,4 раза, Р˂0,05), к 30 суткам их количество не отличалось от нормы.

В то же время количество Т-супрессоров было самым низким на 2 и 3 сутки после резекции, к 7 суткам их количество увеличилось, а к 30 суткам не отличалось от нормы. Индекс дифференцировки Т-лимфоцитов (Th/Ts) на 2-е сутки составил 1,43, на 3 сутки – 2,33 (в норме 1,5), к 30 суткам он снизился до 1,64.

Таблица 1. Количество иммунокомпетентных клеток в крови после резекции печени (в %)

Динамика 0-лимфоцитов была менее выраженной. Отмечалось лишь небольшое достоверное снижение этого класса клеток через 7 суток после операции.

Общее количество лимфоцитов достоверно не изменялось в течение всего срока наблюдения, за исключением 7 суток, когда их число снизилось примерно на 18% по сравнению с нормой.

Введение спленопида животным после резекции печени вызывает некоторое снижение общего числа лимфоцитов, особенно заметное на 7 сутки (на 24%, Р˂0,05).

Количество В-лимфоцитов на все сроки наблюдения было выше нормальных значений, достоверно на 2-е сутки

(Р˂0,05).

Количество0-лимфоцитовимелотенденциюкснижению.На2-есуткиихбылона63%меньше,чемуживотных, не получавших спленопид (табл.2).

Таблица 2. Количество иммунокомпетентных клеток в крови после резекции печени и введения спленопида (в %)

НаиболеевыраженныеизменениябылиотмеченыТ-лимфоцитов.Ихколичествоувеличилосьболее,чемв2раза по сравнению с животными, не получавшими спленопид после резекции печени. При этом количество Т-хелперов увеличилось также в 2,2 раза, а Т-супрессоров еще более снизилось. В результате соотношение Th/Ts увеличилось до 3,79. Через 3-е суток эти изменения были не выражены, а через 7 суток вновь увеличилось количество Т-хелперов и снизилось число Т-супрессоров. В результате индекс дифференцировки Т-лимфоцитов увеличился до 3,0, что более, чем в 2 раза, чем у животных, не получавших препарат. К 30 суткам показатели иммунитета как у оперированных животных, получавших спленопид, так и не получавших его, достоверно не отличались от нормальных показателей.

Относительная масса печени у животных после резекции через 2 суток была снижена на 20%, через 3 суток она отличалась только на 13%, а к 7 суткам достигла нормальных значений – 3,3±0,26 (в норме – 3,44±0,12). Через 30 суток этот показатель был несколько ниже нормы. У животных, получавших после резекции печени спленопид, относительная масса печени была выше нормальных значений уже через 2 суток (4,36±0,41), через 3 суток она снизилась практически до нормальных значений, но к 7 суткам произошло новое повышение до 4,68±0,22, что на 23% выше, чем у животных, не получавших препарат. Через 30 суток относительная масса печени у животных, получавших спленопид, была выше, чем у животных, не получавших данный препарат, и практически не отличалась от нормы.

Увеличение относительной массы печени у животных, получавших спленопид после резекции, происходит, как было показано выше, в сроки, когда наблюдается самая высокая активность Т-хелперов и самая низкая активность Т-супрессоров (2 и 7 сутки). Это свидетельствует о более высокой скорости и полноте регенерации под влиянием спленопида.

133