70. Фенотипическая и генотипическая изменчивость прокариот.

Ответ. Генотип - вся совокупность имеющихся у организма генов. Фенотип - совокупность реализованных (внешних) генетически закрепленных признаков, т.е. индивидуальное проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип бактерий может изменяться при сохранении генотипа. Изменчивость у бактерий может быть фенотипической (ненаследуемой) и генотипической (передаваемой по наследству). Фенотипической изменчивостью называют временные, ненаследуемые изменения признаков, возникающие в ответ на изменившиеся условия окружающей среды. После устранения причины, вызвавшей изменение признака бактерии возвращаются к исходному фенотипу. Генотипическая изменчивость подразделяется на мутации и рекомбинации. Мутации - скачкообразные изменения наследственного признака. Могут быть спонтанные и индуцированные, генные (изменения одного гена) и хромосомные (изменения двух или более двух участков хромосомы). Рекомбинации - изменчивость, связанная с переносом генетической информации от одной бактерии (донора) другой (реципиенту). Генетические рекомбинации могут осуществляться путем трансформации, трансдукции или конъюгации. Трансформация – непосредственный захват, поглощение и встраивание в свой геном бактерией реципиентом фрагментов ДНК погибших бактерий из питательной среды. Трансдукция - перенос генетического материала от бактерии донора к бактерии реципиенту умеренными фагами. Конъюгация - перенос генетического материала от донора реципиенту с помощью плазмид. Плазмиды - внехромосомные молекулы ДНК наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий - интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры в цитоплазме - автономные плазмиды.

71. Подходы и критерии при идентификации.

Ответ. При идентификации культур проводят определение их родовой и видовой принадлежности, а при необходимости и внутривидовое типирование. Результат получают по совокупности данных: морфологических, основанных на выявлении характерных особенностей ультраструктуры возбудителя и их тинкториальных свойств (чаще окраска по Граму); кулътуральных, основанных на выделении чистой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде, с изучением особенностей выросших колоний; биохимической активности культур. В том числе: оксидазной и каталазной активности, способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий. Реже используются тесты ассимиляции азота, определение уреазной активности и активности отдельных специфических ферментов; иммунологических, основанных на выявлении антигенов (АГ) возбудителя или антител (АТ) к ним. Идентификацию возбудителей по их антигенным свойствам проводят в реакциях ориентировочной агглютинации, ко-агглютинации, латексной агглютинации, преципитации или иммунофлюоресценции (прямой или непрямой). Антитела к возбудителю определяют в серологических реакциях: развернутой реакции агглютинации, непрямой агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммуноферментном и радиоиммунном методах и др.; молекулярно-генетических, основанных на определении специфичных нуклеотидных последовательностей в цепи ДНК при помощи короткой эталонной цепи ДНК (праймера). С этой цель используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию и их модификации, метод генетических зондов, сэндвич-гибридизацию и др. Морфологические и тинкториальные методы. Позволяют выявить характерные морфологические структуры возбудителя непосредственно в клиническом материале, путем приготовления мазков окрашенных простыми или сложными методами. Ценность бактериоскопического метода состоит в простоте, доступности методик и быстроте получения результатов. Однако специфичность его в связи с близостью морфологии разных видов мала, а чувствительность ограничена -разрешающая способность метода составляет в среднем 100 000 клеток в мл. Наиболее распространенной методикой окраски является окраска по Граму, что позволяет судить о строении клеточной стенки микроорганизмов. Окраска по Нейссеру позволяет выявить специфические метахроматические включения волютина, по Цилю-Нильсону – кислотоустойчивые бактерии, по Ожешки- споры, по Бурри-Гинсу- капсулу. Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют провести прижизненное изучение микроорганизмов, обнаружить их специфическую подвижность. Люминисцентная микроскопия используется как метод экспрессдиагностики в прямом и непрямом вариантах. Исследование носит ориентировочный характер. Классический бактериологический метод остается «золотым стандартом» при диагностике большинства современных инфекций. Этот метод предполагает посев материала на плотные питательные среды с последующим выделением и идентификацией чистой культуры микроорганизма, определением чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам и бактериофагам. Основной недостаток классического метода – длительность исследования. Так, по быстрорастущим микробам результат может быть получен не ранее, чем через 2-3 суток после посева на плотную среду. Рост микроскопических грибов регистрируется существенно позже от 5-7 дней и до 21 дня. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженной диафрагмой. Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более). Форма колонии бывает правильная — круглая, неправильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев. Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей. Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др. Для идентификации выделяемых культур по биохимическим свойствам в состав сред обычно вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В классическом варианте это углеводы (лактоза, сорбит, сахароза и т. д.), мочевина пли другие субстраты, при расщеплении которых микробными ферментами образуются вещества, изменяющие рН или окислительно-восстановительный потенциал среды. В результате появления продуктов ферментации индикатор окрашивает, например, колонии микробов и среду вокруг, помогая отличить их от бесцветных (неокрашенных) колоний микробов, не ферментирующих данный субстрат. Дифференциация при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты Рост лактозоположительных бактерий на среде Эндо микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителен разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных сред. Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты. Различные виды и даже разновидности микробов относятся поразному к одним и тем же сахарам. Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, «пестрый ряд» — дифференциально - диагностические среды. Среду Гисса выпускают полужидкой с индикатором BP (смесь водного голубого и розоловой кислоты). В качестве углеводов используют пентозы (арабинозу, ксилозу, рамнозу), гексозы (глюкозу, левулезу, маннозу, галактозу), дисахариды (мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу, мелибиозу), трисахариды (раффинозу, мелицитозу), полисахариды (инулин, декстрин, растворимый крахмал, гликоген), высокоатомные спирты (глицерин, эритрит, адонит, арабит, маннит, дульцит, сорбит, инозит), глюкозиды (салицин, эскулин, кониферин, арбутин). Исследуемую культуру засевают уколом петли в столбик среды, и нкубируют втермостате при 37°С сутки или более в зависимости от идентифицируемого вида. По изменению цвета индикатора после посева судят об образовании кислых продуктов; заполнение поплавка газом или разрыв агара указывает на образование газа из углевода. Если культура не ферментирует углевод, цвет индикатора не изменяется и образования газа не наблюдается. Протеолитические свойства микроорганизмов. Среды, содержащие белок и выявляющие способность микробов расщеплять белки: мясо-пептонная желатина «столбиком», свернутая лошадиная или бычья сыворотка, молоко, мясо-пептонный бульон. Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. При посеве бактерий проколом в мясо-пептонную желатину, «столбиком» в случае расщепления белка наблюдают разжижение среды. При посеве на среду со свернутой сывороткой расщепление белка определяют по разжижению среды и образованию углублений на ее поверхности. Расщепление микробом молока выявляется просветлением или растворением первоначально свернувшегося молока. В посевах в пептонную воду определяют продукты расщепления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 °С путем постановки реакций на аммиак, индол, сероводород и др. У анаэробов протеолитическая активность приводит к образованию масляной и уксусной кислот и NH3 или глутаминовой кислоты и СО2. Липолитическая активность микроорганизмов. Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. В среду добавляют водный раствор твина соответствующей концентрации (твин 80, 40 или 20). Среду разливают в чашки Петри. Когда агар застывает, на поверхность агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соответствующей температуре необходимое для роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина. Примерами липолитической активности является тест на лецитовителлазную активность бактерий. Обнаружение свободных жирных кислот, ароматических соединений (диацетил, ацетоин), гемолитической активности (фосфолипазы бактерий), обнаружение арахидоновой кислоты и др. В последнее время широко используют "хромогенные" питательные среды, позволяющие уже на первом этапе микробиологического исследования, через 24 часов получить видовое название возбудителей. Такие хромогенные питательные среды разработаны, как для бактериальных культур, так и микроскопических грибов. Это дифференциальные среды нового поколения, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. К таким ферментам относятся, например, /J-D-глюкуронидаза Escherichia coli или /S-D-глюкозидаза энтерококков. Для обнаружения уникального фермента и, соответственно, идентификации микроорганизма, в состав среды вводят хромогенный субстрат вещество, при расщеплении которого этим ферментом образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате микробный рост окрашивается в определенный цвет или приобретает способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав сред (в том числе селективных) для первичного посева, то результат выделение чистой культуры и ее идентификация может быть получен уже в течение первых суток исследования. Иногда при этом требуется проведение быстрых подтверждающих тестов (например, капельный тест на индол с реактивом Ковача для Е coli). По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую и жидкостную. Газовая хроматография включает газожидкостную и газотвердофазную; жидкостная – жидкостно-жидкостную и жидкостно-твердофазную. Первое слово в названии метода характеризует агрегатное состояние подвижной фазы, второе – неподвижной. Указанные хроматографические методы дают возможность проводить качественный и количественный анализы лекарственных средств, изучать их физико-химические свойства, осуществлять контроль и автоматическое регулирование технологических процессов. Позволяют обнаружить составные части клеточной стенки возбудителей в исследуемом материале. но и специфичные для данной группы микроорганизмов метаболиты. Иммунологическая диагностика. Определение антигенов возбудителей часто является единственным методом экспресс- диагностики. Основан на обнаружении антигенов возбудителя в крови или иных биологических жидкостях, т. е. частиц возбудителя. Широко используются различные реакции агглютинации, преципитации и их модификации, а также РИФ (прямой или непрямой варианты). Реакция агглютинации на стекле. Агглютинация зависят от АГ строения бактериальной клетки (микроорганизма). Корпускулярные частицы (бактерии, клетки) находящиеся во взвешенном состоянии в присутствии АТ склеиваются между собой. Ставится с чистой культурой возбудителя и диагностическими агглютинирующими сыворотками. Позволяет идентифицировать возбудителя по его антигенным свойствам. Н-агглютинация сопровождается образованием крупных хлопьев и проявляется быстро. О-агглютинация сопровождается образованием мелких зерен и проявляется медленно. Реакция Ко-агглютинации. Белок А стафилококков имеет сродство к Fc- фрагменту иммуноглобулинов. Бактерии, обработанные иммунной сывороткой, неспецифически адсорбируют АТ. Антитела диагностикума взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Реакция агглютинации латекса. Достоинства: Высокая чувствительность, высокая специфичность, размер антигена не имеет значения, стабильность реагента, простота постановки и учета. Для постановки используют частицы латекса (полистерола) с адсорбированными на их поверхности АТ (антительный диагностикум). При положительной реакции наблюдают образование фестончатого осадка- «розетки агглютинации». При отрицательном результате- образование «пуговки» Реакция иммунофлюоресценции. Прямая: АГ микроорганизмов при взаимодействии с АТ диагностической сыворотки, меченной флюорохромами дают свечение в УФ - лучах люминисцентного микроскопа. Непрямая: Ставится два этапа. Введена как система индикации дополнительно антиглобулиновая сыворотка (к иммуноглобулинам кролика), меченная флюорохромом. Положительной считается интенсивность свечения (+++, ++++). Масс-спектрометрия (MALDI TOF) матричная времяпролетная мaсс-спектрометрия позволяет проводить точную идентификацию более 4000 видов микроорганизмов, сокращая при этом сроки идентификации на 24–72 часа. Один из важных показателей – экономичность методики, которая почти не требует затрат на реактивы и расходные материалы. В клинической микробиологии позволяет с высокой точностью определить количественный и качественный состав вещества, его структуру, физико-химические реакции. Масс-спектрометры используются для: идентификации микроорганизмов в биологических средах — мицелиальных грибов, дрожжей, грамположительных и грамотрицательных бактерий, видового типирования бактерий — выявления их родовой и видовой принадлежности, определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, создания генетического паспорта человека. Метод выявляет уникальный набор белков микроорганизмов своеобразный «отпечаток пальца»- «протеомная дактилоскопия». Позволяет проводить и субтипирование микроорганизмов.