- •Микробиология теория
- •1. Предмет и задачи микробиологии: ее место в современной биологии, роль для народного хозяйства и охраны здоровья.
- •2. Клеточная стенка: структура, химический состав и функции, окраска по Грамму.
- •3. Питательные среды.
- •4. Методы микробиологических исследований. Микроскопия. Правила работы с микроскопом.
- •5. Спиртовое брожение.
- •6. Процессы трансформации соединений фосфора.
- •7. Краткая история развития микробиологии.
- •8. Поступление питательных веществ в клетку прокариот (пассивная диффузия, облегченная диффузия, пассивный перенос, активный транспорт).
- •9. Взаимоотношения микроорганизмов с человеком и животными: нормальная микрофлора и патогенные микроорганизмы.
- •10. Особенности морфоструктуры прокариот.
- •11. Бактериальный фотосинтез и его отличие от фотосинтеза растений.
- •12. Влияние физических факторов среды на бактерии: лучистая энергия, ультразвук, реакция среды, свет.
- •13. Формы прокариот.
- •14. Карбонатное дыхание прокариот.
- •15. Процессы трансформации соединений серы.
- •16. Постоянные и временные структуры бактериальной клетки
- •17. Аэробное дыхание прокариот
- •18. Виды плазмид и их роль.
- •19. Цитоплазма и внутрицитоплазматические включения: строение и их функции.
- •20. Питание прокариот. Питательные вещества, факторы роста. Физиологические группы прокариот.
- •21. Структура генома прокариот.
- •22. Генетический аппарат прокариот.
- •23. Метаболизм прокариот: энергетический и конструктивный.
- •24. Общая характеристика представителей отдела Tenericutes.
- •25. Поверхностные структуры бактериальной клетки: капсула, слизистые чехлы, ворсинки.
- •26. Нитратное дыхание прокариот.
- •27. Разложение целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина и пектина.
- •28. Жгутики: их строение, размещение на клетке, механизм функционирования.
- •29. Пропионовокислое брожение.
- •30. Общая характеристика представителей отдела Firmicutes.
- •31. Эндоспоры и другие покоящиеся формы бактерий.
- •34. Химический состав прокариотической клетки.
- •35. Закономерность роста бактерий в периодической чистой культуре. Кривая роста, фазы роста бактериальной популяции.
- •36. Процессы трансформации соединений железа.
- •37. Ферменты: классификация ферментов, их роль в жизни микроорганизмов, особенности ферментативных реакций.
- •38. Процессы трансформации углеродсодержащих веществ.
- •39. Взаимоотношения микроорганизмов с растениями: Микрофлора ризосферы.
- •40. Молочнокислое брожение (гомо- и гетероферментативное).
- •41. Культивирование иммобилизационных клеток микроорганизмов.
- •42. Рекомбинация генетического материала прокариот. Трансформация, трансдукция, конъюгация.
- •43. Пути катаболизма глюкозы: путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (Гликолиз).
- •44. Выделение чистой культуры и определение ее чистоты.
- •45. Общая характеристика представителей отдела Mendosicutes.
- •46. Анаэробное дыхание прокариот.
- •47. Микробные популяции: колонии, биопленки, зооглеи.
- •48. Влияние химических факторов среды на бактерии.
- •49. Маслянокислое брожение
- •50. Методы стерилизации.
- •51. Распространенность микроорганизмов в природе и их роль в круговороте веществ и других процессах.
- •52. Сульфатное дыхание прокариот.
- •53. Непрерывное проточное культивирование.
- •54. Взаимоотношения микроорганизмов. Ассоциативные и конкурентные взаимоотношения.
- •55. Фумаратное дыхание прокариот.
- •56. Получение накопительной культуры.
- •57. Инфекции.
- •58. Пути катаболизма глюкозы: путь Варбурга-Диккенса-Хореккера (пентозофосфатный).
- •59. Систематика прокариот: задачи, подходы при идентификации, системы классификации.
- •60. Влияние физических факторов среды на бактерии: температура, кислород.
- •61. Биосинтезы органических соединений у микроорганизмов.
- •62. Особенности культивирования анаэробных бактерий.
- •63. Эпифитные и фитопатогенные микроорганизмы.
- •64. Понятие роста, размножения. Основные параметры роста культур: время генерации прокариот, скорость роста и выход биомассы.
- •65. Классификация мутаций.
- •66. Распространение микроорганизмов в природе.
- •67. Поддержание (хранение) культур микроорганизмов.
- •68. Аммонификация белков, нуклеиновых кислот и мочевины.
- •69. Понятие о стерилизации, асептике, антисептике, дезинфекции. Пастеризация.
- •70. Фенотипическая и генотипическая изменчивость прокариот.
- •71. Подходы и критерии при идентификации.
- •72. Иммунитет. Факторы и механизмы естественной устойчивости.
- •73. Нитрификация. Денитрификация.
- •74. Общая характеристика представителей отдела Gracillicutes.
- •75. Антибиотики: механизм и спектр действия антибиотиков.
42. Рекомбинация генетического материала прокариот. Трансформация, трансдукция, конъюгация.
Ответ. Рекомбинация – совокупность процессов, связанных с замещением участка исходной нуклеиновой кислоты на гомологичный (сходный) участок. При этом степень гомологии может быть различной: от полной идентичности исходной и новой нуклеотидных последовательностей до заметных расхождений, приводящих к изменению фенотипа. В результате рекомбинации образуются новые сочетания аллелей, например: AB + ab → Ab + aB. У прокариот существует три способа включения в геном чужеродной ДНК: трансформация, конъюгация и трансдукция. Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов: S– и R–формы. S–форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии; эта форма патогенна для мышей. R–форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии; эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые S-клетки и живые R-клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма. Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы: стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены – факторы компетентности (в частности, специфические белки с низкой молекулярной массой). В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот. Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация. Процесс трансформации включает следующие стадии. Присоединение трансформирующей двунитевой ДНК к рецепторам на поверхности клетки–реципиента. Превращение двунитевой ДНК в однонитевую. Проникновение однонитевой ДНК в клетку. Интеграция трансформирующей ДНК в хромосому реципиента и рекомбинация генетического материала. Длина трансформирующей ДНК должна быть от 500 до 200 тысяч пн. Энергия, выделяющаяся при деградации одной из нитей ДНК, используется для активного транспорта оставшейся нити вовнутрь клетки. Первые три стадии трансформации не зависят от нуклеотидного состава ДНК. Однако процесс интеграции трансформирующей ДНК в хромосому реципиента более вероятен при высокой гомологичности этой ДНК по отношению к ДНК реципиента. На первой стадии трансформирующая ДНК присоединяется к рецепторным сайтам на поверхности клетки–реципиента. На втором этапе двунитевая ДНК на поверхности клетки превращается в однонитевую за счет расщепления одной из нитей бактериальными нуклеазами. На третьем этапе оставшаяся нить ДНК транспортируется через мембрану в цитоплазму. При этом используется энергия, выделившаяся при деградации комплементарной цепи. При репликации бактериальной хромосомы трансформирующая нить ДНК присоединяется к гомологичному (частично комплементарному) участку ДНК клетки–реципиента. При этом из-за отсутствия полной комплементарности образуется гетеродуплекс («молекулярная гетерозигота») – участок двунитевой ДНК, на котором не во всех нуклеотидных парах азотистые основания связаны водородными связями. Остальная часть ДНК реплицируется нормальным образом. После окончания репликации ДНК клетка–реципиент делится с образованием двух клеток: частично трансформированной клетки с хромосомой, включающей гетеродуплексный участок ДНК, и нетрансформированной клетки. При репликации ДНК в частично трансформированной клетке на обеих цепях ДНК происходит достраивание комплементарных цепей. Одна цепь сохраняет исходные последовательности нуклеотидов, а другая становится полностью трансформированной. После деления частично трансформированной клетки образуется одна нетрансформированная клетка и одна полностью трансформированная, у которой исходная последовательность нуклеотидов замещена на последовательность нуклеотидов трансформирующей ДНК. Таким образом, при трансформации происходит замещение генов реципиента на гомологичные нуклеотидные последовательности. Чем выше степень гомологии, тем успешнее протекает трансформация. Частота трансформации у прокариот зависит от свойств трансформирующей ДНК, от ее концентрации, от состояния клетки–реципиента, от вида бактерий. Максимальная частота трансформированных клеток не превышает 1 на 100 клеток. Трансформация известна и для эукариот. Однако на поверхности эукариотических клеток отсутствуют рецепторные сайты, и трансформирующую ДНК вводят в клетки искусственно. Например, в яйцеклетки животных ДНК вводят путем прямой микроинъекции, а в яйцеклетки растений – путем микроинъекции в пыльцевую трубку. Широко используются методы биобаллистики (биолистики), позволяющие вводить любые фрагменты ДНК в культуры тканей растении. Конъюгацией у прокариот называется прямой контакт двух разнокачественных клеток, сопровождаемый хотя бы частичным переносом генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту. (Процесс конъюгации был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Э. Татумом). У кишечной палочки клетка-донор («мужская») имеет продолговатую форму, клетка-реципиент («женская») – изодиаметрическую. Клетка-донор образует половые ворсинки (пили), которые притягивают ее к клетке-реципиенту и образуют цитоплазматические каналы. По этим каналам ДНК из клетки-донора переходит в клетку-реципиент. Существует три типа клеток-доноров: F+, Hfr и F′. F+ -доноры содержат в цитоплазме половой фактор – специфическую F–плазмиду. F–плазмида – это автономный репликон длиной около 100 тпн. В составе F–плазмиды изучено более 20 генов. Примерно половина из них образует гигантский оперон tra (длиной около 30 тпн); продукты этого оперона контролируют образование контакта между донором и реципиентом и собственно перенос ДНК. Остальные гены регулируют работу tra–оперона. Клетка-реципиент не содержит F–плазмиды и обозначается как F– –клетка. При образовании цитоплазматического мостика одна из цепей F–плазмиды надрезается в определенной точке (точка О), а на комплементарной цепи начинается репликация ДНК по принципу «катящегося кольца». Копия комплементарной цепи по цитоплазматическому мостику переходит в цитоплазму клетки–реципиента, и на ней достраивается недостающая цепь. После окончания репликации двунитевая плазмидная ДНК замыкается в кольцо, и F– –клетка превращается в F+ –клетку. Полное время переноса копии F–плазмиды в клетку–реципиент составляет примерно 5 минут. Однако при скрещивании F+ × F– в клетку–реципиент попадают только гены, содержащиеся в F–плазмиде; гены домашнего хозяйства, локализованные в бактериальной хромосоме, в клетку–реципиент не переносятся. В то же время F–плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому, то есть переходить в интегрированное состояние. В бактериальной хромосоме имеется около 20 сайтов интеграции F–плазмиды. Тогда при переносе копии одной из цепей F–плазмиды в клетку–реципиент за ней увлекается и копия одной из цепей бактериальной хромосомы. Клетки с интегрированной F–плазмидой называются Hfr–доноры (от англ. «высокая частота рекомбинаций»). В зависимости от условий возможен полный или частичный перенос копии бактериальной хромосомы Hfr–донора в цитоплазму реципиента. В результате образуется клетка с одной исходной двунитевой бактериальной хромосомой и одной полной или неполной гомологичной однонитевой молекулой ДНК. Такая клетка называется мерозигота («частичная зигота»). Далее при репликации ДНК протекает рекомбинация. Этот процесс принципиально не отличается от рекомбинации при трансформации. Перенос копии ДНК начинается примерно с середины F–плазмидной ДНК (с точки О, в которой одна из цепей ДНК надрезается, и начинается репликация F–плазмидной ДНК). Таким образом, половина F–плазмидной ДНК проникает в клетку–реципиент в начале конъюгации, а вторая половина – только после полного переноса копии хромосомной ДНК. Для полного завершения этого процесса при t = 37С требуется более 100 минут. Однако в природных условиях конъюгация прерывается значительно раньше, в клетку–реципиент переходит только часть копии хромосомы донора и только первая половина F–плазмидной ДНК. Таким образом, клетка-реципиент не принимает свойства Hfr–донора. Однако существуют штаммы бактерий, у которых копия бактериальной хромосомы вместе с копией F–плазмидной ДНК переносится полностью. Такие клетки называются vHfr–доноры (от англ. «очень высокая частота рекомбинаций»). Вероятность переноса определенного гена в клетку–реципиент зависит от его удаления от F–плазмидной ДНК, а точнее, от точки О, в которой начинается репликация F–плазмидной ДНК. Чем больше время конъюгации, тем выше вероятность переноса данного гена. Это дает возможность составить генетическую карту бактерий в минутах конъюгации. Например, у кишечной палочки ген thr (оперон из трех генов, контролирующих биосинтез треонина) находится в нулевой точке (то есть непосредственно рядом с F–плазмидной ДНК), ген lac переносится через 8 мин, ген recE – через 30 мин, ген argR – через 70 мин и т.д. F–плазмида может переходить из интегрированного состояния в автономное путем самовырезания из бактериальной хромосомы. В этом случае возможен захват и части хромосомной ДНК (до 50 % хромосомных генов). F–плазмида, включающая хромосомные гены, называется F′ –фактором. Перенос генетического материала при скрещиваниях F′ × F– называется сексдукция. Кроме F–плазмиды у прокариот известны и другие типы половых факторов (R, Ent, Hly, Col), обеспечивающих перенос генетического материала от бактерии к бактерии. На основе природных плазмид (в том числе ДНК хлоропластов и митохондрий) получены полусинтетические молекулы ДНК, обеспечивающие перенос генетического материала из одной клетки в другую, называются векторы. Векторы должны обеспечивать не только устойчивый перенос генов, но и регуляцию их транскрипции. Прокариотические плазмиды могут реплицироваться только в прокариотических клетках. В то же время, существует необходимость переноса генов от эукариот к прокариотам и наоборот. Для этого используются челночные плазмиды, которые содержат два репликатора (прокариотический и эукариотический) и способны реплицироваться и в прокариотических, и в эукариотических клетках, например, Ti– и Ri–плазмиды, способные к репликации в прокариотических и растительных клетках, и полусинтетические векторы, созданные на их основе. Для защиты векторов от разрушения нуклеазами их заключают в фосфолипидные пузырьки – липосомы. Трансдукцией называется перенос генетического материала с помощью вирусов из клетки-донора в клетку-реципиент. При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина. Вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. Вирусная ДНК интегрируется в бактериальную хромосому, а привнесенная бактериальная ДНК рекомбинирует с ДНК бактериальной хромосомы. В результате 50% клеток оказываются трансформированными. Различают общую (неспецифическую), ограниченную (специфическую) и абортивную трансдукцию. При общей трансдукции фрагменты бактериальной ДНК донора случайно включаются в созревающую фаговую частицу вместе с фаговой ДНК или вместо фаговой ДНК. Фрагменты бактериальной ДНК образуются при ее разрезании ферментом, контролируемым фагом. В состав фаговой частицы может включаться до 100 бактериальных генов. При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация – бактериальная ДНК замещает часть фаговой ДНК. В состав рекомбинантной ДНК входит небольшое количество бактериальных генов, прилежащих к фаговой ДНК, интегрированной в бактериальную хромосому. При общей и ограниченной трансдукции донорская ДНК замещает гомологичные участки ДНК реципиента. Этот процесс сходен с трансформацией. Абортивная трансдукция может быть и неспецифической, и специфической. Ее сущность заключается в том, что трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК не включается в хромосому реципиента, а существует как цитоплазматический репликон. Рано или поздно этот репликон утрачивается. Явление трансдукции вирусами широко используется при переносе генов у эукариот. Если применяется вирус, неспособный формировать капсид (то есть существующий только в форме ДНК), то трансдукция принципиально не отличается от трансформации или от конъюгативного переноса генетического материала с помощью плазмид–векторов. Созданы системы векторов на основе модифицированных вирусов SV40 (они образуют в клетке до 100 тысяч копий), герпеса, осповакцины, вирус мозаики цветной капусты. Следует еще раз подчеркнуть, что все описанные типы рекомбинации связаны не с добавлением новых участков ДНК, а с замещением уже имеющихся нуклеотидных последовательностей. Чем выше степень гомологии трансформирующей и исходной ДНК, тем выше вероятность успешной рекомбинации. Легче всего удается рекомбинация ферментов, имеющихся у всех организмов. Труднее ввести в геном новые регуляторы, отличающиеся высокой специфичностью. Поэтому для внедрения в геном новых генов используются более сложные методы, связанные с биохимическими модификациями ДНК.