43. Пути катаболизма глюкозы: путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (Гликолиз).
Ответ. Наиболее распространенным путем катаболизма глюкозы у многих микроорганизмов является гликолиз. При этом глюкозо-6-фосфат изомеризуется с помощью глюкозофосфатизомеразы и фосфорилируется далее в фруктозо-1,6-дифосфат, который затем расщепляется на 3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) и фосфодиоксиацетон. Последний под действием фермента триозофосфатизомеразы превращается в 3-ФГА. Таким образом, из одной молекулы глюкозы образуются две молекулы 3-ФГА. На эти реакции превращения глюкозы в 3-ФГА затрачивается энергия двух молекул АТФ. Далее происходит окисление каждой молекулы 3-ФГА до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты (1,3-ФГК). 1,3-ФГК – высокоэнергетическое соединение, содержащее макроэргическую фосфатную связь; оно реагирует с АДФ (фермент фосфоглицераткиназа), отдавая высокоэнергетическую фосфатную группу, в результате чего синтезируется молекула АТФ. Таким образом, энергия, освободившаяся при окислении 3-ФГА, путем субстратного фосфорилирования оказывается аккумулированной в молекуле АТФ. Образуется 3-фосфоглицериновая кислота (3-ФГК):
Далее 3-ФГК под действием фермента фосфоглицеромутазы превращается в 2-ФГК, из которой в результате отщепления воды образуется фосфоенолпировиноградная кислота (ФЕП). Это также высокоэнергетический фосфат, с которого богатая энергией фосфатная группа переносится пируваткиназой на АДФ, образуется молекула АТФ и пировиноградная кислота (ПВК). Это второе фосфорилирование на уровне субстрата:
Таким образом, при распаде одной молекулы глюкозы образуется четыре молекулы АТФ, в которых аккумулируется освободившаяся энергия. Поскольку в начале процесса на активирование глюкозы были затрачены две молекулы АТФ, чистый выход АТФ на одну молекулу глюкозы составляет две молекулы. Суммарное уравнение гликолиза можно записать следующим образом: С6Н12О6 + 2АДФ + 2Фн + 2НАД → 2С3Н4О3 + 2АТФ + 2НАД · Н2.
44. Выделение чистой культуры и определение ее чистоты.
Ответ. Чистая культура микроорганизма - это популяция клеток одного вида, выросшая на стерильной питательной среде. Чистую культуру выделяют путем получения потомства одной родительской клетки. Культура может расти в виде отдельных колоний на плотной питательной среде. Все методы выделения чистых культур из микробных смесей можно разделить на 2 группы: Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов; Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов. Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов. Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На первую чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в третью чашку Петри и аналогичным образом производят посев. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний (сплошной pocт) на третьей - минимальное в виде отдельно расположенных колоний. Метод истощающего штриха. В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив её на 4 сектора и последовательно засеяв штрихом. Для этого материал берут петлёй и проводят ею на расстоянии 5 мм друг от друга ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие секторы. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток. После рассева чашки переворачивают вверх дном, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри, не мешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате 1-7 суток, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастают обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки. Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 минут. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают, образуя колонии только спорообразующих бактерий. Метод обогащения. Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов. Метод заражения лабораторных животных. Этот метод используется для выделения чистой культуры из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, или в том случае, когда в исследуемом материале очень мало патогенных микроорганизмов. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных. Например, для выделения пневмококка из мокроты заражают белую мышь. Это животное весьма чувствительно к данному микробу и резистентно к другим микробам, находящихся в мокроте. В связи с этим пневмококк быстро размножается в организме мыши, а другие микробы погибают. Через 18-20 часов после заражения мышь забивают и кровь, взятую из сердца, засевают на питательную среду. Так как в крови содержится один пневмококк, то на питательной среде вырастает чистая культура. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов. Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других, находящихся с ним в смеси. Метод Шукевича. Применяется для выделения подвижных микроорганизмов. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, находящегося в пробирке. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы "вползают" на его поверхность. Из верхней части роста производят высев в конденсационную воду свежей питательной среды. Производя таким образом несколько пересевов, в конце концов получают чистую культуру подвижной бактерии. Метод ингибирования. Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определённые вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Первый этап выделения чистой культуры. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Производят посев на чашки Петри с питательным агаром. Для этого исследуемый материал, в случае необходимости, разводят стерильным физиологическим раствором. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательной среды в чашке Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещяют в термостат при 37ºС на 18-24 ч. Производят посев на элективную питательную среду. Производят посев на дифференциально-диагностическую среду. Заражают лабораторных животных исследуемым материалом. Выросшие изолированные колонии отсевают бактериологической петлей на поверхность скошенной агаризованной среды в пробирке. Поскольку изолированные колонии иногда могут формироваться не только из отдельных клеток, обязательным этапом выделения чистой культуры должна быть проверка их однородности. Это осуществляется несколькими способами: визуальным, микроскопическим, высевом на соответствующие питательные среды. При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на поверхности скошенной среды; в том случае, если рост неоднороден, считают, что культура загрязнена и требуется ее дополнительная расчистка. При описании колоний бактерий определяют их диаметр в миллиметрах, пигментацию, форму, высоту, профиль, вид края, поверхность колоний, отмечают степень прозрачности колоний и их консистенцию. На характеристики колоний могут влиять среда, возраст культуры, условия культивирования. Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать путем микроскопии клеток. Для этого готовят препарат фиксированных окрашенных клеток, который микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки чистых культур микроорганизмов, как правило, однородны по размеру и окраске по Граму. Однако следует помнить, что колонии, вырастающие из чистой культуры могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах многих бактерий могут появляться кокковидные клетки, цисты, споры. Наконец, многие микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Чистоту культуры клеток проверяют также и путем повторного рассева на селективные среды, обеспечивающие избирательный рост тех или иных микроорганизмов. Критерием чистоты в этом случае является однородность формирующихся при этом колоний.