30. Общая характеристика представителей отдела Firmicutes.

Ответ. Отдел включает 2 больших класса – Бациллы и Клостридии, и еще 3 малых класса. Молекулярные маркеры: все представители характеризуются низким содержанием ГЦ-пар. Окраска по Граму: грамположительные, а также отдельные грамотрицательные бактерии, которые родственны грамположительным фирмикутам согласно сиквенсам 16S рДНК. Морфология клетки: палочки (одиночные или в цепочках), чаще подвижные (перитрихиальное жгутикование). Часть видов образует овальные или сферические эндоспоры, обычно растягивающие клетки. Класс Клостридии – плеоморфные клетки (чередуются кокки и палочки, прямые или изогнутые палочки), чаще подвижные (перитрихи) палочки, одиночные, в парах, цепочках. Образуют овальные или сферические эндоспоры, обычно растягивающие клетки (например, в форме барабанных палочек), либо неспорообразующие. Класс Бациллы – прямые грамположительные палочки, обычно правильной формы, с закругленными или «обрубленными» концами, часто в парах или цепочках. Подвижны (перитрихи) или неподвижны. Образуют овальные эндоспоры, либо спор не образуют. Примеры: род Bacillus, Lactobacillus. Физиология: большинство видов хемоорганотрофы (метаболизм бродильного типа). Некоторые способны к сульфатному дыханию (Clostridia). Встречаются галофилы (Clostridia). У многих видов класса Bacilli конечным продуктом брожения является молочная кислота. Отношение к кислороду: облигатные анаэробы (Clostridia); аэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы (Bacilli). Отношение к температуре: мезофилы или термофилы (Clostridia). Образ жизни: некоторые виды патогенны для животных и человека, либо в результате размножения (раневой инфекции), либо в результате попадания токсинов.

31. Эндоспоры и другие покоящиеся формы бактерий.

Ответ. При переходе к неблагоприятным условиям существования многие прокариоты образуют особые дифференцированные формы – покоящиеся клетки, основным назначением которых является обеспечение переживания вида в неблагоприятных условиях. Их общей морфологической особенностью являются утолщенные клеточные стенки, а также частое образование дополнительных поверхностных структур на фоне одновременной дегидратации и компактизации метаболического и генетического аппаратов. В результате этого покоящиеся клетки характеризуются чрезвычайно низким (фоновым) уровнем обмена веществ и энергии, но приобретают повышенную устойчивость к действию разнообразных повреждающих факторов: высоких и низких температур, кислотности среды, радиации и пр. При попадании же в благоприятные условия покоящиеся клетки прорастают с образованием активно метаболизирующих вегетативных клеток. Покоящиеся формы прокариот можно условно разделить на несколько видов: эндоспоры, экзоспоры, цисты, акинеты. Эндоспоры – это особый тип покоящихся клеток эубактерий, формирующихся внутри цитоплазмы родительской клетки и обладающих специфическими структурами: внутренней и наружной мембранами, кортексом и многослойными белковыми покровами. К спорообразующим относится большое число эубактерий, относящихся к 15 родам, и имеющих клеточную стенку типичную для грамположительных бактерий. У аэробных микроорганизмов процесс спорообразования лучше всего изучен у р. Bacillus, и у анаэробов р. Clostridium. Переход к процессу спорообразования является дефицит питательных веществ, накопление в среде продуктов метаболизма, действующих по принципу кворум-зависимых регуляторных факторов. В упрощенном виде у бациллюс субтилис споруляция регулируется системой из сигнального олигопептида, фосфатазы и белковых факторов споруляции. При достижении высокой плотности популяции, олигопептид в большом количестве поступает в клетку, инактивирует фосфатазу,активирует таким образом белковые факторы споруляции и запускает программу споруляции. Последующий процесс споруляции можно рассматривать как неравновеликое бинарное деление особого типа, при котором одна из образующихся клеток формирует отмирающий спорангий, а вторая превращается в покоящуюся эндоспору. Спорообразованию всегда предшествует репликация ДНК, часть которого компактизируется и в составе т.н. «ядерного тяжа» переходит в ту часть клетки, где в последующем и будет формироваться спора. Компактизированный материал теряет свою метаболическую активность на ранних стадиях спорообразования, а сам процесс формирования споры контролируется геномом спорангия. Помимо разделения генетического материала, в клетке активно идут процессы дегидратации (в споре остается 15% воды), ДНК переходит из В-формы в А-форму, что существенно повышает устойчивость к УФ лучам, белки распадаются до специфичного для спор и отсутствующего у вегетативных клеток вещества – дипиколиновой кислоты (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислоты. В ходе ее образования происходит также интенсивное поглощение клеткой ионов кальция, образующего с кислотой хелатное соединение, составляющее 10-15% сухого вещества зрелых спор. Визуально же это проявляется как блестящие тела на фоне темных клеток. Далее начинается процесс обособления протопласта: ЦПМ впячивается вовнутрь как при делении, но потом протопласт обрастает ЦПМ родительской клетки вторым слоем. Между внутренней и внешней мембраной начинает формироваться кортекс – многослойный пептидогликан, отличающийся высокой степенью поперечной сшивки. Вслед за этим поверх наружной мембраны синтезируются дополнительные многослойные «споровые покровы», состоящие из белков, липидов и гликолипидов. Белки эндоспор богаты цистеином и гидрофобными аминокислотами, что обеспечивает их дополнительную устойчивость, в частности радиорезистентность. Далее у некоторых бактерий формируется еще одна структура – «экзоспориум», окружающий спору в виде свободного чехла и имеющий характерное для каждого вида тонкое многослойное строение. После завершения процесса спорообразования происходит лизис спорангия, после чего спора высвобождается в окружающую среду. Споры могут сохраняться в течении сотен лет в окружающей среде. При наступлении благоприятных условий происходит прорастание споры, проходя три стадии: активацию, инициацию и вырастание. Экзоспоры фототрофных бактерий формируются в результате отпочковывания от одного из полюсов материнской клетки. Они не имеют каких-либо особенных поверхностных структур, однако клеточная стенка значительно плотнее и толще аналогичной структуры вегетативной клетки. Экзоспоры миксобактерий - миксоспоры – формируются в т.н. «плодовом теле» псевдоплазмодия, клетки переходят в покоящееся состояние, их клеточная стенка утолщается и окружается капсулой. Цисты распространенный тип покоящихся клеток, образуемые представителями разных групп эубактерий, виды Azotobacter и скользящие бактерии. При истощении пищевых ресурсов в цисту превращается вся палочковидная клетка, а не только какая-то ее часть, что сопровождается изменением ее морфологии. Происходящие изменения включают потерю жгутиков, накопление в цитоплазме гранул поли-бета-гидроксимаслянной кислоты и образованием дополнительных клеточных покровов. Между ЦПМ и КС – формируется «интина», а поверх КС – «экзина». Возникающие толстостенные шарообразные покоящиеся клетки – цисты – устойчивы к высушиванию, механическим нагрузкам и облучению, но не к дейтсвию высоких температур. Акинеты - это особая форма сохранения у планктонных нитчатых цианобактерий, обладающая повышенной устойчивостью к ряду пониженным температурам, высушиванию, но не к повышенным температурам. В акинету превращается вся вегетативная клетка, которая начинает этот процесс с увеличения своих размеров и накопленияв цитоплазме гранул запасных веществ (гликогеновых, полифосфатных, цианофициновых), а также карбоксисом при одновременном уменьшении количества хлорофилла и фикобилиновых пигментов. Пептидогликановый слой КС утолщается, окружающий слизистый чехол уплотняется за счет полисахаридных фибрилл. Под действием силы тяжести акиеты опускаются на дно водоемов и перезимовывают, а весной прорастают, после чего молодые, снабженные газовыми везикулами вегетативные клетки всплывают к поверхности воды.

32. Пути катаболизма глюкозы: путь Энтнера-Дудорова.

Ответ. Путь Энтнера – Дудорова встречается у прокариот реже других. Он характерен в основном для псевдомонад и уксуснокислых бактерий. От пентозофосфатного пути он отличается тем, что 6-фосфоглюконовая кислота превращается в пировиноградную кислоту и 3-ФГА. Последний может превращаться в пировиноградную кислоту. Из одной молекулы глюкозы при функционировании этого пути синтезируется одна молекула АТФ, по одной молекуле НАДФ · Н2 и НАД · Н2. Следует подчеркнуть, что путь Энтнера – Дудорова является самым кратчайшим механизмом расщепления углеводов до пировиноградной кислоты.

33. Биологическая фиксация молекулярного азота.

Ответ. Фиксация молекулярного азота (N2) – это биологический восстановительный процесс. Первым его продуктом является аммиак, который затем включается в азотистые соединения, доступные для использования другими организмами. Азотфиксация играет большую роль в круговороте азота в природе, в обогащении почвы и водоемов связанным азотом. Единственными организмами, способными осуществлять этот процесс, являются бактерии, которые называются азотфиксирующими, или диазотрофами, так как они могут использовать как N2, так и связанные формы азота. Азотфиксация обнаружена у представителей разных групп бактерий, включая аэробные, анаэробные и фототрофные бактерии. Азотфиксирующие бактерии подразделяют на три группы: симбиотические, свободноживущие и ассоциативные. Симбиотические азотфиксаторы усваивают молекулярный азот, только находясь в симбиозе с растением. Особо важное значение имеет симбиоз между клубеньковыми бактериями рода Rhizobium и бобовыми растениями. К симбиотическим азотфиксаторам относятся также бактерии рода Bradyrhizobium (симбиоз с люпином, соей, вигной, машем, арахисом и т. д.), бактерии рода Azorhizobium (симбиоз с бобовыми растениями). Бактерии родов Rhizobium, Bradyrhizobium и Azorhizobium входят в α-подгруппу протеобактерий и формируют корневые и стеблевые (Azorhizobium) клубеньки у бобовых растений. Актиномицеты рода Frankia также обитают в качестве эндосимбионтов в клубеньках, которые образуются на корнях небобовых растений, как древесных и кустарниковых, так и травянистых, среди которых ольха, облепиха, стланик, казуарина, восковница, лох, шефердия, куропаточья трава и др. Актиномицеты рода Frankia также обитают в качестве эндосимбионтов в клубеньках, которые образуются на корнях небобовых растений, как древесных и кустарниковых, так и травянистых, среди которых ольха, облепиха, стланик, казуарина, восковница, лох, шефердия, куропаточья трава и др. Некоторые симбиотические азотфиксаторы, относящиеся к роду Klebsiella, образуют клубеньки на листьях кустарников Pavetta и Psychotria. Цианобактерии Anabaena azollae образуют симбиотическую ассоциацию с водным папоротником Azolla (цианобактерии находятся в листовых полостях папоротника), внося большой вклад в азотфиксацию на рисовых плантациях, где этот папоротник растет на поверхности покрывающей почву воды. Цианобактерии рода Nostoc вступают в симбиоз с мхами-печеночниками и тропическим растением Gunnera macrophylla. Cимбиотические цианобактерии присутствуют в лишайниках, представляющих собой ассоциацию этих прокариот с грибами. Благодаря тому, что цианобактерии осуществляют азотфиксацию и имеют фотоавтотрофный тип метаболизма, нуждаясь для роста только в СО2, N2 и минеральных солях, лишайники первыми заселяют неорганические среды, создавая условия для развития других организмов. К свободноживущим азотфиксаторам относятся некоторые виды бактерий рода Clostridium (C. pasteurianum, C. butyricum, C. acetobutyricum, C. felsineum, C. pectovorum и др.), бактерии родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia, Derxia, большинство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобактерии, факультативные анаэробы (Klebsiella pneumoniae, Bacillus polymyxa), хемолитоавтотрофные бактерии (Xanthobacter autotrophicus, Alcaligenes latus), метилотрофные (бактерии родов Methylomonas, Methylobacterium и Methylococcus), сульфатредуцирующие (бактерии родов Desulfotomaculum и Desulfovibrio) и метаногенные бактерии. Ассоциативные азотфиксаторы – бактерии, обитающие в ризоплане (на поверхности корней), ризосфере (в почве, окружающей корни) и филлосфере (на листьях, стеблях) растений, т. е. живущие в ассоциации с высшими растениями. К активным азотфиксаторам, развивающимся в ризосфере и ризоплане различных растений, относятся бактерии азоспириллы (Azospirillum lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A. halopraeferans и др.), Klebsiella planticola, Herbaspirillum seropedicae, представители рода Pseudomonas и др. Бактерии, обитающие в филлосфере, называются эпифитными, среди которых имеются азотфиксаторы, например Pantoea agglomerans. Реакцию восстановления молекулярного азота до аммиака катализирует фермент нитрогеназа. Известны три типа ферментов нитрогеназ. Наиболее распространенный тип содержит молибден, в других типах этого фермента вместо молибдена присутствует ванадий или железо. Некоторые азотфиксирующие бактерии в зависимости от наличия в среде молибдена или ванадия способны синтезировать два или даже три (Azotobacter spp.) типа нитрогеназ. Все типы нитрогеназ состоят из двух белковых компонентов. Компонент 1 – это собственно нитрогеназа, или MoFe-белок (динитрогеназа, или молибдоферредоксин); компонент 2 – это редуктаза динитрогеназы, или Fe-белок (FeS-белок, или азоферредоксин). Фермент нитрогеназа высокочувствителен к молекулярному кислороду – он инактивируется на воздухе и в аэробных условиях его синтез прекращается. Таким образом, фиксация азота представляет собой строго анаэробный процесс. Клубеньковые бактерии – это грамотрицательные подвижные палочки. Они относятся к микроаэрофильным микроорганизмам, способным развиваться при низком парциальном давлении кислорода в среде. Оптимальная для роста клубеньковых бактерий температура 24–26 ºС. Клубеньковые бактерии хемогетеротрофы, т. е. в качестве источника углерода и энергии используют органические вещества, часто нуждаются в некоторых витаминах – тиамине, пантотеновой кислоте, биотине. Они обычно существуют свободно в почве, их количество зависит от характера почвы и ее предшествующей сельскохозяйственной обработки. При свободном существовании в почве используют связанный азот, т.е. утрачивают способность фиксировать азот атмосферы. Клубеньковые бактерии обладают выраженной специфичностью в отношении бобовых растений: каждый их вид вызывает образование клубеньков на корнях одного или группы близких видов бобовых. У клубеньковых бактерий за фиксацию атмосферного азота ответственен nif-оперон, который локализован в Sуm-плазмидах. Гены nif-оперона детерминируют синтез нитрогеназы – основного фермента, участвующего в фиксации молекулярного азота. Для фиксации молекулярного азота необходимы восстановительная сила и энергия. Энергия затрачивается на преодоление высокого активационного барьера для разрыва первой из трех чрезвычайно устойчивых при нормальной температуре связей в молекуле N≡N. В условиях промышленного синтеза NН3 из Н2 и N2 (реакция Харбера-Боша) этот барьер преодолевается под действием высокой температуры и высокого давления в присутствии металлсодержащих катализаторов. Затраты АТФ и восстановителя при биологической фиксации азота настолько велики, что скорость роста бактерий и экономический коэффициент с использованием N2 в качестве источника азота значительно ниже, чем в присутствии NН3. Восстановитель и молекулы АТФ синтезируются в процессе брожения, дыхания или фотосинтеза. Восстановителем в нитрогеназной реакции служит восстановленный ферредоксин (в условиях дефицита железа он заменяется флаводоксином). Восстановление ферредоксина может происходить различными путями. У оксигенных фототрофных цианобактерий ферредоксин восстанавливается фотосистемой I на свету и пируват: ферредоксин-оксидоредуктазой в темноте. У анаэробных хемотрофов он восстанавливается ферредоксин-зависимыми оксидоредуктазами, такими как пируват: ферредоксин-оксидоредуктаза, гидрогеназа и формиатдегидрогеназа. У аэробных хемотрофов и аноксигенных фототрофов восстановление ферредоксина происходит при участии НАДФН и ферредоксин: НАДФ+-оксидоредуктаз. У аэробных хемолитоавтотрофов ферредоксин восстанавливается путем энергозависимого обратного переноса на него электронов от НАДФН. Восстановление одной молекулы N2 до двух молекул NН3 описывается следующим уравнением:

Данный процесс осуществляется в три последовательные стадии. Вначале N2 превращается в диимид (НN = NН), затем в гидразин (Н2N – NН2) и, наконец, в NН3. Нитрогеназная система катализирует АТФ-зависимое восстановление не только молекулярного азота, но и ацетилена (НС ≡ СН), азида, закиси азота, цианидов, нитритов, изонитрилов и протонов.